轉基因水稻Bt63的外源基因相對含量分析

孫長坡 鄧婷婷 伍松陵 路子顯

（國家糧食局科學研究院1，北京 100037）

（中國檢驗檢疫科學研究院食品安全研究所2，北京 100025）

轉基因水稻研究始于1988年，日本東北大學的Toriyama等［1］和英國諾丁漢大學的 Zhang等［2］分別以水稻原生質體為材料，利用電擊法獲得了水稻再生植株。同時，美國康乃爾大學的Zhang等［3］以水稻原生質體為材料，利用PEG介導法獲得了水稻再生植株。1991年，Christou等［4］利用基因槍法轉化水稻取得成功，隨后，這種轉化方法成為水稻遺傳轉化的常規方法之一。1993年，我國臺灣Chan等［5］采用農桿菌介導法獲得轉基因水稻。1994年，日本的Hiei等［6］利用水稻成熟種子誘導的愈傷為受體，建立了農桿菌介導的粳稻高效轉化體系。Hiei等［7－8］在2006年和2008年先后改進了這個高效轉化體系，使農桿菌介導法變成水稻遺傳轉化的最常用方法。

Tu等［9］在 2000年將轉cry1Ab／Ac融合基因水稻進行田間試驗，在不噴灑殺蟲劑條件下，發現轉抗蟲基因水稻對二化螟、三化螟和稻縱卷葉螟具有高度殺傷作用。曾千春等［10］把cry1Ac基因導入秈稻明恢81獲得抗蟲純合系。Ghareyazie B等［11］將cry1Ab／2A轉化水稻，發現轉基因水稻對二化螟、三化螟和稻縱卷葉螟高度殺傷力。

轉基因水稻中外源基因拷貝數的研究方法很多，其中Southern Blot方法［12］是最常用的轉基因植株的外源基因拷貝數分析方法，其他方法還有CGH，FISH［13］和 Micro array［14］等。但是，這些方法存在不足之處如下：需要DNA量多、量大、費時、使用放射性同位素、發生重排的外源基因測定不準確等。隨著轉基因的谷物的種植和流通，轉基因成分的檢測和監測技術研究也不斷發展和創新。一種快速、敏捷和高效的實時熒光定量PCR技術已經受到越來越廣泛的應用。2009年，我國農業部為轉基因水稻Bt63頒發了生物安全證書，其抗蟲能力與外源基因的拷貝數密切相關。本研究之目的是利用實時熒光定量PCR技術，分析不同的轉基因稻米Bt63的外源基因相對含量，為建立轉抗蟲基因水稻抗蟲能力評價體系和轉基因稻谷進入糧食流通渠道提供檢測和監測技術。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 試驗材料

待測樣品（轉基因Bt63稻米粉末）U1和U2各1 g／瓶，校準品（質粒DNA含有目的基因）1瓶，內源標準基因上下游引物（RBE－4－F和RBE－4－R）與內源標準基因探針（RBE－4－MGB－P）各1支，外源基因上下游引物（Bt63－F和Bt63－R）與外源基因探針（Bt63－P）各1支，以上材料均由中國計量科學研究院提供。

1.1.2 試驗試劑

植物基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。TaqMan?2×PCR Mater Mix：羅氏公司。

1.1.3 試驗儀器

實時定量PCR分析系統（7900HT快速實時PCR系統）；DNA濃度測定儀器為Nanodrop 1000分光光度計（熱科學基因有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 轉基因水稻基因組DNA提取

根據試劑盒操作手冊提取和純化待測樣品（轉基因Bt63稻米粉末）U1和U2的DNA。利用DNA濃度測定儀器測定DNA含量。

1.2.2 Taqman探針法反應條件

外源基因PCR反應體系25μL，其中2×Taqman Universal MasterMix緩沖液12.5μL，10μmol／L上下游引物各1μL，10μmol／L外源基因探針 0.5μL，DNA模板（＜30 ng／μL）5μL。內源基因PCR反應體系也是25μL，其中2×Taqman Universal MasterMix緩沖液12.5μL，10μmol／L上下游引物各0.5μL，10μmol／L內源基因探針 0.25μL，DNA模板（＜30 ng／μL）5μL。反應條件：50℃，2 min；95℃，10 min；40個循環（95℃，15 s；60℃，60 s）。ABI Prism?7900型熒光定量PCR儀在60℃復性和延伸時收集熒光信號。

1.2.3 標準曲線的建立及數據分析

外源基因的標準曲線的制作是將帶有目的基因的質粒 DNA按10、100、1 000、10 000和100 000倍稀釋，并以這些稀釋的DNA為模板進行PCR反應，得到各自的Ct值，通過Ct值與起始模板數的對數值之間存在的線性關系，獲得標準曲線。水稻內源的標準曲線的制作是以基因組 DNA做100、1 000、10 000、100 000和1 000 000倍稀釋，用與外源基因標準曲線相同的方法獲得。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的制作

2.1.1 內源標準曲線

RBE－4基因的標準曲線如圖1所示：RBE－4基因的標準曲線的相關系數R＝0.996 6，說明已經滿足了熒光定量的標準曲線的精度要求。該基因Ct值與起始模板之間的相關性方程為：y＝2.734 3x＋41.268，方程式中y代表Ct值，x代表log COPY。

圖1 RBE－4基因real－time PCR標準曲線

2.1.2 外源標準曲線

Bt63基因的標準曲線如圖2所示：Bt63基因的標準曲線的相關系數R＝0.995 4，說明相關性很高。該基因Ct值與起始模板之間的相關性方程為：y＝－2.326 0x＋39.319，方程式中y代表Ct值，x代表log COPY。

圖2 Bt63基因（B）real－time PCR標準曲線

2.2 轉基因水稻Bt63的內外源基因的Ct值

在本試驗中，對兩個不同的轉基因樣品U1和U2分別進行3次熒光定量PCR反應，每次設3個重復。獲得樣品的Ct值如表1。

表1 RBE－4基因和Bt63基因在U1和U2中的Ct值

表2 RBE－4基因和Bt63基因在U1中拷貝數和比值

表3 RBE－4基因和Bt63基因在U2中拷貝數和比值

從表1可知，在內外源基因之間，外源基因（Bt63）Ct值高于內源基因（RBE－4）Ct值。在 U1和U2樣品之間，雖然二者的內源基因（RBE－4）Ct值差異不顯著，但是，U1的外源基因（Bt63）Ct值高于U2的外源基因（Bt63）Ct值。

2.3 轉基因水稻Bt63的內外源基因的拷貝數

根據內外源基因的標準曲線方程，計算出它們各自對應的基因拷貝數，進一步計算出外源基因在兩個轉基因水稻中的相對含量見表2和表3。

從表2中數據算出：U1的外源基因平均含量為0.28%，SD為0.001 4，RSD為0.498 1。

從表3中數據算出：U1的外源基因平均含量為0.018%，SD為0.009 8，RSD為0.544 4。

3 討論

隨著國內外轉基因水稻的商品化步伐提速和我國對轉基因糧油及其制品的進口規模的加大，相應的外源基因含量檢測技術的研究也不斷深入。最近幾年，我國利用實時熒光定量PCR技術在轉基因水稻的外源基因拷貝數或含量研究上正方興未艾。楊立桃等［15］比較了實時熒光定量PCR和Southern blot兩種技術在水稻轉GUS和HPT基因拷貝數研究中的差異，發現實時熒光定量 PCR的分析結果與Southern blot分析結果基本一致，僅個別樣品稍高。然而，利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現性最好的定量方法。因此，實時熒光定量PCR方法已得到全世界的公認，廣泛用于基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。王育花等［16］通過SYBR實時熒光定量PCR法檢測了轉基因水稻中NAS1的拷貝數。林波等［17］利用實時熒光定量PCR技術測定了不同轉基因水稻中Bar和CaMV35S相對含量。敖金霞等建立了檢測轉基因水稻深加工產品的外源基因的TaqMan和SYBR Green I方法的定量檢測技術，兩者的檢測靈敏度均達到0.01%［18］。

針對轉基因水稻Bt63檢測技術的研究目前鮮見報道。我們的研究結果表明：兩個轉基因Bt63稻米樣品U1和U2的外源基因含量存在一定的差異。由于本次試驗樣品較少，僅重復3次，不僅U1和U2的內源基因Ct值沒有很好落在內標曲線上，而且U2的外源基因Ct值也沒有很好落在外標曲線上。這些問題將在以后的試驗中加以改進和提高。

通過熒光定量PCR技術能夠完成轉基因成分的定量分析。2009年11月27日 ，農業部批準發放轉基因抗蟲水稻“華恢1號”和“Bt汕優63”安全證書。雖然尚未允許商業化生產，但提前研究和開發相應的檢測技術將為轉基因稻谷進入流通行業儲備技術支持。

4 結論

本試驗較早地利用熒光定量PCR技術研究了兩個轉基因Bt63稻米樣品U1和U2的外源基因含量，發現它們的外源基因含量存在顯著差異。這項研究的繼續深入將為建立轉基因水稻抗蟲能力評價體系和轉基因稻谷進入糧食流通渠道提供檢測和監測技術基礎。

志謝：感謝中國檢驗檢疫科學研究院食品安全研究所陳穎研究員和黃文勝研究員給予的幫助。感謝中國計量科學研究院董蓮華博士、隋志偉和李亮提供轉基因水稻樣品（稻米粉末）和有關生物試劑。

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［19］EC Regulation 1998／11391 Council Regulation（EC）No 1139／98 of 26 May 1998 Concerning the Compulsory Indication of the Labeling of Certain Foodstuffs Produced from Genetically Modified Organisms of Particulars other than Those Provided for in D79／112／EEC1 Brussels，Belgium 1L159：4－7.