大鼠Mettl9基因的克隆及其慢病毒表達載體的構建＊

黃柏勝，彭志宏，韓 仰，舒坤賢，劉發益，鄔力祥*

(1．中南大學湘雅醫學院生理學系，湖南 長沙410078;2．重慶郵電大學生物信息學研究所，重慶400065)

甲基轉移酶樣基因9(methyltransferase like9，Mettl9)定位于大鼠染色體1q36，該基因是一種類甲基化轉移酶，屬于DREVl轉甲基酶基因家族，與DREVl基因的相似性很高［1］，它是一個新發現的p53下游基因，在人和小鼠的同源基因為METTL9/PAP1基因，有關該基因的研究報道也非常少。研究發現，METTL9/PAP1基因在肺癌、小鼠胎肺的發育過程中特異性表達，且其表達信號的強弱與凋亡細胞的強弱成正相關［2－5］，其在胚胎發育過程中的作用很可能是通過參與細胞凋亡來實現的［3］;在胃癌和結腸癌的癌組織，METTL9基因表達上調，抑制細胞凋亡［6-7］。為進一步揭示Mettl9基因的功能，我們克隆了大鼠Mettl9基因，構建了含該基因的慢病毒載體，并在293T細胞進行慢病毒包裝，為研究該基因的功能奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1．1 材料

DMEM培養基(Hyclone公司)，新生牛血清(杭州四季青公司)，Trizol(Invitrogen公司)，PCR TaqMix(廣州東盛生物公司)，瓊脂糖(Spanish公司)，E．Z．N．A．Gel Extraction Kit(OMEGA公司)，pGEM-T Vector System(Promega公司)，大腸桿菌DH5α菌株為本室保存，慢病毒載體pLenti6．3-MCSIRES-EGFP(Invitrogen公司)，核酸分子量標準(TaKaRa公司)，酵母浸出粉、精解蛋白胨(Oxoid公司)，小量質粒快速提取試劑盒(北京博大泰克公司)，PacI、AscI、BamHI、XhoI和T4連接酶以及逆轉錄試劑盒(Fermentas公司)。

1．2 方法

1．2．1 目的基因的體外擴增與克隆 從原代培養的大鼠星形膠質細胞中，按照Trizol說明書提取該細胞的總RNA，逆轉錄成cDNA。根據GenBank中的Mettl9基因序列(NM_001163164)，設計一對RT-PCR引物，覆蓋完整的閱讀框，引物序列如下:上游5'-CCTCGAGATAGACTGTTGGCGGGCTGGCTGTGCC-3'，下游5'-GGATCCCGTTACACTGGTCTGAGAACAAAG ACAGC-3'，分別在上、下游引物加XhoI和BamHI酶切位點(下劃線部分)，引物由上海博尚生物技術公司合成。通過T-A克隆，將DNA凝膠回收純化后的PCR產物與pGEM?-T Vector通過T4連接酶連接構建重組質粒pGEM?-T-Mettl9。

1．2．2 陽性克隆的酶切鑒定與測序 采用XhoI和BamHI雙酶切鑒定上述重組質粒，取雙酶切初步認定正確的重組質粒進行DNA序列測定(由上海博尚生物技術公司完成)。

1．2．3 含Mettl9基因的慢病毒表達載體的構建根據目的基因設計合成亞克隆PCR引物，上游、下游引物5'端分別加入PacI、AscI酶切位點序列(下劃線部分)，引物序列如下:上游5'-ATCATGTTAATTAAGCCACCATGAGACTGTTGGCGGGCTG-3'，下游5'-ATTATTGGCGCGCCTTACACTGGTCTGAGAACAA AGACAGC-3';用以上引物從質粒pGEM?-T-Mettl9中擴增目的基因片段，將PCR產物電泳用DNA凝膠回收試劑盒回收，再用PacI和AscI對目的基因片段和pLenti6．3-MCS-IRES-EGFP空載體同時進行酶切2 h，將酶切產物電泳并回收酶切后的目的基因片段和pLenti6．3-MCS-IRES-EGFP，T4連接酶連接回收的目的基因片段和載體，室溫連接2 h，連接產物轉化DH5α感受態細胞，挑取陽性克隆，搖菌，提取小量質粒雙酶切及測序鑒定。

1．2．4 慢病毒表達載體的病毒上清包裝 取細胞狀態良好，處于對數生長期的293T細胞，采用lipofectamine2000轉染所構建的慢病毒載體至293T細胞，37℃，5%CO2的培養箱中孵育24 h后，更換完全培養液DMEM+10%FBS。轉染換液24 h后，收集培養上清，為慢病毒液第一次收集，再加入10 mL新鮮的完全培養基。轉染換液48 h后，再次收集培養上清，為慢病毒液第二次收集。將兩次收集到的病毒原液混合均勻后，4℃，3 000 r/min離心30 min，去除細胞和碎片，上清用0．45μm的濾器過濾。最后進行慢病毒液的濃縮和分裝，將慢病毒原液50，000 g，4℃超速離心2 h，去除上清，沉淀溶解在含有2%FBS的DMEM中。根據實驗具體要求進行分裝，并留樣進行滴度測定。

1．2．5 慢病毒活性滴度測定 慢病毒滴度測定前一天細胞鋪板，293T細胞經胰酶消化后輕輕吹打成單細胞懸液，細胞計數后鋪96孔板，約8 000個細胞每孔。72 h后，在熒光顯微鏡下觀察各孔中熒光細胞數量，病毒滴度為各孔中表達熒光的細胞數平均數除以每孔中含有的慢病毒液體積。

1．2．6 包裝后的慢病毒表達載體在U251細胞的表達 用包裝后含有目的基因的慢病毒表達載體感染培養的U251細胞，48 h后倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的表達情況。

2 結果

2．1 大鼠Mettl9基因的克隆

2．1．1Mettl9基因的RT-PCR擴增 提取大鼠星形膠質細胞的總RNA，逆轉錄為cDNA后行PCR擴增，擴增產物經1．2%瓊脂糖凝膠電泳，得到大小約為954 bp的片段，與目的基因片段大小一致(圖1)。

2．1．2 重組質粒pGEM?-T-Mettl9的雙酶切鑒定結果 將PCR擴增產物經DNA凝膠回收純化后與pGEM?-T Vector連接，經XhoI和BamHI雙酶切鑒定，得到兩條分別約3 000 bp的pGEM?-T空載體和954 bp的插入片段(圖2)。

2．1．3 重組質粒pGEM?-T-Mettl9的序列測定取酶切正確的重組質粒進行序列測定，由上海博尚生物技術公司測序，測得序列全長為954 bp(圖3)，將序列向GenBank遞交獲收錄號HQ898855。

2．2 慢病毒載體pLenti6．3－Mettl9－IRES-EGFP的構建

2．2．1 慢病毒載體pLenti6．3－Mettl9－IRES-EGFP的雙酶切鑒定 取陽性克隆的質粒，用PacI和AscI雙酶切鑒定，得到約9 387 bp的慢病毒載體片段和954 bp的插入片段(圖4)。

圖1 大鼠Mettl9基因的PCR擴增Fig．1 PCR amplification of rat Mettl9 gene

圖2 重組質粒酶切鑒定Fig．2 Enzyme digestion of the recombinant plasmid

圖3 重組質粒pGEM?-T-Mettl9的序列測定圖Fig．3 The sequencing map of pGEM?-T-Mettl9

圖4 慢病毒表達載體pLenti6．3－Mettl9－IRES-EGFP的雙酶切鑒定Fig．4 Double-enzyme digestion of lentiviral vector pLenti6．3－Mettl9－IRES-EGFP

2．2．2 慢病毒載體的包裝結果 慢病毒載體在293T細胞包裝24 h后，由于表達載體帶有GFP報告基因，在熒光顯微鏡下可以看到外源基因大量表達后所發生的綠色熒光(圖5)。

圖5 慢病毒載體在293T細胞包裝24 h后的熒光和可見光結果Fig．5 The image of lentiviral vector pLenti6．3－Mettl9－IRES-EGFP packaged in 293T cells for 24 h under microscopy

2．2．3 慢病毒載體活性滴度測定結果 慢病毒對293T細胞系具有感染能力，并且與不同的稀釋倍數相關，慢病毒對細胞的感染力直接反映在帶綠色熒光的細胞數量上(圖6)。從圖6可以明確地看到，病毒液稀釋的倍數越高，感染的細胞越少。對GFP計數后可知，本實驗中該慢病毒載體的生產體系所獲得的病毒滴度約為1．825×108TU/mL。

圖6 包裝后的慢病毒載體滴度測定(100×)Fig．6 Measurement of viral titer(100×)

2．2．4 包裝后的慢病毒載體感染體外培養的U251細胞 用慢病毒載體感染膠質瘤U251細胞，48 h后在倒置熒光顯微鏡下可見綠色熒光(圖7)，說明所構建的慢病毒表達載體在293T細胞包裝后能將目的基因導入細胞內。

圖7 包裝后的慢病毒載體pLenti6．3－Mettl9－IRESEGFP在U251細胞的表達Fig．7 The expression of lentiviral vector pLenti6．3－Mettl9－IRES-EGF in U251 cells

3 討論

p53基因生物學效應主要是通過激活或抑制大量下游基因表達來完成的，p53及其下游基因所組成的p53基因調控網絡才是調節細胞生命活動的根本，而p53基因處于這個調控網絡的關鍵節點。P53蛋白主要功能包括誘導細胞周期阻滯、DNA的修復和促進細胞凋亡，從而避免受損DNA的堆積、維持基因組的穩定性，以及調節細胞的分化與衰老、抑制腫瘤血管增生等。大量研究證明p53下游基因主要包括:p21、CD95/fas、p53AIP1、pag608、gadd45、mdm2、bax、pig3、Cyclin G等［8］，正是這些受p53基因調控的下游基因直接實現p53基因的眾多生物學功能。Mettl9基因是一個新發現的p53下游基因，與小鼠、人的序列同源性分別為98%、93%，該基因的激活可能主要是通過P53蛋白與其特異性序列結合，從而促使或抑制該基因的轉錄和翻譯;該基因與野生的p53結合，DNA上的多個基因位點發生高度甲基化，導致腫瘤抑制因子等重要基因失活。研究發現，在胃癌、結腸癌組織中METTL9基因的表達與p53基因表達呈負相關［6，7］。在小鼠胚胎發育的不同時期Mettl9基因表達信號的強弱與凋亡信號幾乎成正相關。在腦損傷中，p53基因的表達上調，抑制p53基因的表達則對腦缺血性損傷組織具有一定的保護作用。在大鼠腦缺血再灌注損傷過程中誘導的p53基因表達的上調與細胞凋亡信號的強度一致。在腦缺血后海馬CA1區p53的表達增多。由制滴菌素A誘導的C6細胞凋亡中，p53的表達特異性的增高［9］。在大鼠視網膜缺血性再灌注損傷中，p53基因的表達與細胞凋亡有密切的關系，可能起促進細胞凋亡的作用。

從UniGene數據庫中檢索可知Mettl9、METTL9與PAP1屬于不同物種的同源基因。我們克隆了大鼠Mettl9基因，并向GenBank遞交獲得收錄號HQ898855。在本研究中我們提取了原代培養的大鼠星形膠質細胞的總RNA，逆轉錄為cDNA，擴增出Mettl9基因。首先構建了重組質粒pGEM?-T-Mettl9，便于大量擴增獲取目的基因，在構建慢病毒載體時采取直接擴增上述重組質粒的目的基因，連接到慢病毒載體上進行包裝。慢病毒載體基于HIV改造產生的，相對于以往使用的腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒載體等，具有容納外源性目的基因片段大，在體內表達穩定，免疫反應小以及安全性較好等優點［10-13］，目前，慢病毒載體經過不斷改造優化，在生物安全性、病毒滴度及靶細胞嗜性范圍方面均有提高，不會引起導致靶細胞死亡的免疫反應，并能夠提供高效的基因轉移和長期穩定的蛋白表達。包裝細胞系的建立是獲得完整病毒顆粒并得以轉染靶細胞的關鍵步驟，所獲病毒滴度的高低對基因治療成功與否尤其重要。本研究中選用來源于人胚腎細胞系的293T包裝細胞完成對慢病毒載體的包裝，我們獲得用于轉染真核靶細胞的完整病毒顆粒，測得病毒滴度為1．825×108TU/mL。腦膠質瘤是臨床上顱內腫瘤中最常見的一種，起源于神經外胚層細胞，其發生發展是一個多步驟、多階段及多基因參與的遺傳性疾病，p53抑癌基因失活在膠質瘤向癌的轉變過程中起著重要作用。本研究我們用含Mettl9基因的慢病毒載體的包裝系統感染腦膠質瘤U251細胞，48 h后熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白的表達，說明含目的基因的慢病毒表達載體包裝成功并能感染體外培養的細胞，慢病毒載體的成功構建為進一步研究Mettl9基因的功能奠定了實驗基礎。

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