芬太尼、咪達唑侖復合麻醉對大鼠認知功能及海馬NR1、NR2B 表達的影響

趙艷梅，閆玉仙，常留栓，陳 寧

多項研究發現，有些藥物麻醉及術后常可發生認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)［1］，表現為認知能力異常、記憶受損、焦慮、人格改變、精神錯亂等，嚴重者可出現癡呆，其確切機制迄今不明。研究認為，大腦神經元數量、與認知有關的神經遞質谷氨酸、乙酰膽堿等及相應受體不足，引起神經元突觸可塑性的改變可能是POCD 產生的原因之一［2］。海馬富含谷氨酸能神經元，一直認為是與學習記憶有關的重要腦區。為了闡明海馬神經元中谷氨酸受體與麻醉產生的認知障礙之間的關系，本研究測定了芬太尼、咪達唑侖復合麻醉對大鼠認知功能的影響，并檢測了與學習記憶相關的谷氨酸受體——N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體亞單位NR1 和NR2B 在大鼠海馬組織中的基因表達變化，探討NMDA 受體與認知障礙形成的相關機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

芬太尼(湖北宜昌人福藥業有限責任公司，批號060208)、咪達唑侖(江蘇恩華藥業股份有限公司，批號20111219)、鹽酸納洛酮(美國Sigma 公司);氟馬西尼(海南靈康制藥有限公司，批號:091103);BP-2 大鼠無創血壓計(成都泰盟科技有限公司)、Y 型電迷宮(張家港市生物醫學儀器廠);DY-89 Ⅱ型電動玻璃勻漿器(寧波新芝生物科技股份有限公司);RNA 提取試劑盒(北京全式金生物技術有限公司);TaKaRa RNA PCR Kit AMV3.0(大連寶生物工程有限公司);100bp DNA MarkerⅠ、GoldView 核酸染料(北京博邁德科技發展有限公司);瓊脂糖(Sigma)，引物合成由北京奧科生物技術有限公司完成。

1.2 實驗動物及分組

雄性Wistar 大鼠18 只，SPF 級，體重180～220g，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK-(軍)2007-004。雄性Wistar 大鼠隨機分為3 組，分別為對照組、復合麻醉組、催醒組，每組6 只，復合麻醉組和催醒組均腹腔注射芬太尼0.5mg/kg、咪達唑侖50mg/kg 進行麻醉誘導，催醒組大鼠在麻醉起效30min 后腹腔注射納絡酮0.5mg/kg、氟馬西尼0.8mg/kg 進行動物催醒。對照組腹腔注射等體積的生理鹽水。

1.3 麻醉誘導與復蘇

1.3.1 一般生理指標測定 復合麻醉組及催醒組動物在整個麻醉誘導與復蘇過程中，每隔5～10min監測大鼠體溫、呼吸頻率、心率和血壓。其中心率和血壓的變化采用大鼠無創血壓計觀察，溫度計記錄肛溫，通過觀察大鼠胸廓運動來記錄呼吸頻率。

1.3.2 麻醉起效及復蘇時間測定 麻醉誘導效應以翻正反射消失為標準。以大鼠前爪不能自行翻轉為俯臥位，且維持時間≥10s 作為大鼠前爪翻正反射消失的標準。催醒組大鼠于誘導起效30min后注射拮抗劑納絡酮0.5mg/kg 和氟馬西尼0.8mg/kg 催醒動物，記錄動物復蘇時間。復合麻醉組記錄自然復蘇時間。

1.4 復合麻醉對大鼠認知功能的影響(Y 迷宮實驗)

動物麻醉復蘇后繼續飼養7d，1～7d 每日進行Y 迷宮實驗，觀察麻醉誘導及催醒對大鼠認知功能的影響。具體方法如下:在安靜的暗室內用Y 迷宮測定。Y 迷宮箱底為銅柵間隔，每臂末端有信號燈，燈亮時箱底的銅柵無電流，提示為安全區。每次測試均在同一時間段進行，測試時調節刺激電壓以保證大鼠在10s 內逃避跑動，大鼠受電擊后直接跑到安全區為正確反應，否則為錯誤反應。每次大鼠跑至安全區后持續光亮15s，繼而熄燈45s 后行下一次測試，燈光出現的方位按照隨機次序變換，每日連續測量10 次，觀察其正確反應次數，以正確反應率作為認知功能的評價指標。

1.5 麻醉誘導與藥物催醒對NR1、NR2B 基因表達的影響(RT-PCR)

Y 迷宮實驗結束后立即斷頭處死大鼠，于冰臺上分離雙側海馬，立即裝入EP 管中置于液氮保存備用。根據NR1(GenBank NM_017010.1)和NR2B cDNA 序列(GenBank M91562.1)，采用Primer Premier 5.0 軟件自行設計引物，NR1:Sense:5’-TCGGTATCAGGAATGCG-3’;Anti-sense:5’-GGTGCTCGTGTCTTTGG-3 ’，328bp;NR2B:5 ’-GCTCAGCGACCTGTATGG-3’，Anti-sense:5’-TCGTCACTGCGTTCTTTGT-3’，381bp;β-actin:Sense:5’-CTGAGAGGGAAATCGTGCGT-3’，Anti-sense:5’-TGGAAGGTGGACAGTGAGGC-3’，448bp。PCR 反應條件見表1。

表1 PCR 反應條件

RNA 提取方法按照試劑盒說明書進行。擴增產物進行1.8%瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀下觀察結果，圖像采用Image J 分析軟件進行處理。以目的基因條帶的綜合光密度與β-actin 基因條帶綜合光密度的比值作為目的基因的相對含量。

1.6 統計學處理

采用SPSS 10.0 軟件進行統計分析，不同組別間的基因表達含量及Y 迷宮實驗數據比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 大鼠麻醉誘導與復蘇時間及一般生理指標的變化

大鼠麻醉及復蘇期間狀態平穩，體溫、呼吸頻率、心率和血壓均無明顯變化。復合麻醉組麻醉起效時間(翻正反射消失時間)為3.12±0.25min，自然復蘇時間為72.25±12.15min;催醒組大鼠麻醉起效時間為3.28±0.29min，給予拮抗劑后復蘇時間為23.25±5.78min，較復合麻醉組復蘇時間明顯縮短(P＜0.01)。

2.2 麻醉誘導對大鼠認知功能的影響

大鼠Y 迷宮認知功能的測定見表1。由表1 可以看出，復合麻醉組與正常對照組相比，正確反應率有所下降(P＜0.01)，拮抗劑催醒組與復合麻醉組相比，正確反應率明顯升高(P＜0.01)。提示芬太尼、咪達唑侖復合麻醉對大鼠短期內(1w)學習記憶能力有一定損害作用，麻醉后給予拮抗劑催醒對麻醉導致的學習記憶能力下降有明顯的改善作用。

2.3 麻醉誘導與藥物催醒對NR1、NR2B 基因表達的影響

麻醉誘導與拮抗劑催醒對NR1、NR2B 基因表達的影響結果見表2。由表2 可以看出，復合麻醉組與正常對照組相比，大鼠海馬組織內NR2B mRNA 表達量顯著降低(P＜0.01)，催醒組NR2B mRNA 表達量與復合麻醉組相比顯著升高(P＜0.01)，與正常對照組相比無明顯差異。NR1 mRNA 表達量在各組間均無明顯變化。說明芬太尼、咪達唑侖復合麻醉可降低海馬部位的NR2B 的mRNA 表達，使用拮抗劑催醒可顯著增加海馬部位的NR2B 的mRNA 表達。

表1 各組大鼠Y 迷宮實驗結果(±s)

表1 各組大鼠Y 迷宮實驗結果(±s)

與對照組比較＊＊P＜0.01;與復合麻醉組比較##P＜0.01

表2 麻醉誘導與拮抗劑催醒對大鼠海馬NR1、NR2B mRNA 表達的影響(±s)

表2 麻醉誘導與拮抗劑催醒對大鼠海馬NR1、NR2B mRNA 表達的影響(±s)

與對照組比較＊＊P＜0.01;與復合麻醉組比較##P＜0.01

3 討論

越來越多的證據表明，全身麻醉后大腦發生了基因表達改變［3］、β 淀粉樣沉積［4］、神經元凋亡［5，6］等廣泛而持久的變化，單純的短時間麻醉即可造成實驗動物長時間的認知功能障礙［7～9］，臨床上常常表現為術后認知功能障礙(POCD)。Moller 等［10］在一項臨床調查中發現，10%～14%的老年患者全身麻醉或手術后發生了長期的認知功能障礙。而中年和青年患者術后1 至2w 的認知功能障礙也有很高的發生率［11］。咪達唑侖是一種常見靜脈麻醉藥物，是當前臨床應用的唯一的水溶性苯二氮艸卓類藥物，臨床上常與芬太尼類化合物配伍使用。研究發現，鎮靜劑量的咪達唑侖可以抑制大鼠的記憶獲得和鞏固并維持較長一段時間［12］，大鼠腹腔注射咪達唑侖可出現東莨菪堿所致的認知功能障礙加重的現象［13］，因此認為咪達唑侖可能是導致POCD 的一個重要因素。芬太尼是一種強效麻醉性鎮痛藥，屬于阿片受體激動劑，與咪達唑侖在鎮痛、催眠作用上具有一定的協同作用，可減少單一藥物的用藥劑量，減輕不良反應［14］。本研究采用Y 迷宮實驗觀察了芬太尼和咪達唑侖麻醉后對大鼠認知功能的影響，結果發現，芬太尼、咪達唑侖復合麻醉后7d 內大鼠逃避傷害刺激的正確反應率有所下降(P＜0.01);拮抗劑催醒組與復合麻醉組相比，正確反應率明顯升高(P＜0.01)。提示芬太尼、咪達唑侖復合麻醉短期內對大鼠學習記憶能力即認知功能有一定損害作用，麻醉后快速給予納洛酮(阿片受體拮抗劑)和氟馬西尼(苯二氮艸卓類受體拮抗劑)催醒對麻醉導致的學習記憶能力下降有明顯的改善作用。

谷氨酸是哺乳動物腦內最重要的一種興奮性氨基酸，其參與長時程增強(LTP)的產生和大腦的興奮性傳遞，對大腦的學習記憶能力起重要作用。而谷氨酸主要是通過其離子型受體N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)介導一系列高級神經活動，它被認為是突觸可塑性和皮質及海馬神經元LTP 的主要調控者，是構成中樞神經系統學習記憶功能的重要基礎。NR1 是NMDA 受體復合物的功能性亞單位，是NMDA 受體通道的必要組成部分，它的含量代表了NMDA 受體的總量，NR2B 是主要的調節亞單位，可以反映NR 受體的功能變化。有研究證明:選擇性敲除小鼠海馬CA1區錐體細胞的NR1 亞單位后，其NMDAR 誘導的LTP 被破壞，且小鼠表現為空間記憶障礙［15］。慢性復合應激可通過使NR2B表達增多增強大鼠的學習記憶［16］。鉛中毒可導致海馬神經元NR2B 表達下降并引起不同程度記憶受損［17］。敲除NR2B 基因后小鼠記憶能力下降，而移植轉染NR2B 基因可使大鼠記憶明顯增高［18］。以上說明，NR1 和NR2B 受體的功能與學習記憶密切相關。因此，本研究選取了NR1 和NR2B 兩種亞基進行研究，通過觀察2 種亞基的mRNA 表達變化，間接反映NR 受體的功能，探討麻醉后認知障礙與NMDA 受體的關系。

RT-PCR 實驗結果顯示，復合麻醉組與正常對照組相比，大鼠海馬組織內NR2B mRNA 表達量顯著降低(P＜0.01)，催醒組NR2B mRNA 表達量與復合麻醉組相比顯著升高(P＜0.01)，與正常對照組相比無明顯差異。NR1 mRNA 表達量在各組間均無明顯變化。說明芬太尼、咪達唑侖復合麻醉可降低海馬部位的NR2B 的mRNA 表達，使用拮抗劑催醒可顯著增加海馬部位的NR2B 的mRNA 表達。該結果與大鼠Y 迷宮實驗結果相一致，提示海馬組織內NR2B 表達下降可能與認知障礙的產生關系密切，該結果與以往研究相一致［19，20］。NR1 基因表達在認知障礙大鼠并未出現表達改變，研究推測NR1基因在認知過程的形成中起著必不可少的作用，但是認知障礙的形成可能主要由調節亞單位NR2B 的變化引起，NR2B 基因可能起著調節學習記憶功能的重要作用。具體NMDA 受體在認知障礙的形成過程中行使何種功能，各亞型之間存在何種相互作用，NMDA 受體與其他受體蛋白是否存在交互作用，具體機制如何將是我們下一步研究的方向。

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