兔出血癥不同佐劑滅活疫苗的制備及免疫效果比較

葉青華

（成都農業科技職業學院，四川 成都 611130）

1 材料與方法

1.1 試驗用兔 成都農業科技職業學院實訓場飼養的未經兔出血癥疫苗免疫的商品兔，體重2～2.5kg。

1.2 種毒 RHDV地方毒株。采取兔出血癥病死兔的肝、脾組織，去除周圍的筋膜，在滅菌生理鹽水中清洗數次，加適量PBS液，于組織勻漿機中完全搗碎，然后按1∶5比例加入滅菌PBS液，經37℃～-80℃反復凍融3次。1500r/min離心10min，取上清液，再加入1000IU/mL的青、鏈霉素，37℃感作2h。將上述處理好的病料，感染未經免疫的敏感兔，使其發病。取發病兔的肝組織加滅菌PBS液搗碎，1500r/min離心10min，取上清液，HA滴度在1∶1280以上即可備用。

1.3 佐劑 蜂膠，氫氧化鋁膠。

1.4 兔出血癥不同佐劑滅活苗的制備

1.4.1 兔出血癥組織滅活苗的制備 無菌采取人工感染發病后的兔肝、脾，按1∶10比例加入滅菌PBS液搗碎，1500r/min離心10min，在上清液中加入0.4%的甲醛，放在37℃搖床中滅活48h。

1.4.2 兔出血癥蜂膠佐劑滅活苗的制備 取市場上購置的優質蜂膠搗成細末，按1∶4的比例加入95%的食用酒精，置23℃水浴24 h，其間不斷搖勻，取出冷至室溫，3 800 r/min離心30 min，取上清液即為蜂膠乙醇浸液。將1.4.1制備的兔出血癥組織滅活苗與蜂膠乙醇浸液按1∶3比例混合，勻漿，4℃下作用24 h即成蜂膠佐劑疫苗。

1.4.3 兔出血癥鋁膠佐劑滅活苗的制備 用去離子水將三氯化鋁配成8%的溶液，加溫至56～60℃；再用去離子水將氫氧化鈉配成4%的溶液，緩慢加入三氯化鋁溶液中，調節pH至5.6～6.0，再加溫10min，分裝瓶中，121℃高壓蒸汽滅菌30min，即成鋁膠佐劑。將1.4.1制備的兔出血癥組織滅活苗與鋁膠佐劑按1∶1比例混勻，即成鋁膠佐劑滅活苗。

1.4.4 疫苗檢驗 按常規方法檢查其物理性狀，并進行菌檢及安全性檢驗。

1.5 免疫接種 選取未經兔出血癥疫苗免疫的試驗兔16只，隨機分成4組，每組4只，隔離飼養。1～3組分別于頸部皮下注射兔出血癥組織滅活苗、蜂膠佐劑苗、鋁膠佐劑苗1mL，第4組于頸部皮下注射滅菌生理鹽水1mL。接種后7、14、45、85、145d進行耳靜脈采血，用微量法作血凝抑制試驗檢測抗體效價。

1.6 攻毒保護試驗 攻毒病料制備：將兔出血癥病料加入少量PBS液在組織搗碎機中充分磨碎，然后制成1∶5懸液，經37℃～-80℃反復凍融3次。1500r/min離心10 min，取上清液,內加1 000 IU/mL的青、鏈霉素，37℃感作2h即成。

試驗兔全部攻毒。分別在疫苗接種后7、15、50、90、150d進行攻毒試驗，每只肌注病料液1mL。

2 結果

2.1 抗體檢測 4組試驗兔全部進行抗體檢測，其結果見表1。

2.2 攻毒保護試驗 非免疫對照組試驗兔48h內全部死亡，剖檢均呈現出典型的兔出血癥癥狀。免疫組攻毒結果詳見表2。

表1 免疫兔血清抗體檢測結果

表2 攻毒保護試驗結果

3 小結與討論

3.1 3種疫苗均于免疫后7d產生抗體，此時，蜂膠佐劑苗的抗體滴度最高，鋁膠佐劑苗的抗體滴度最低。14d后，佐劑苗的抗體滴度均高于組織滅活苗的抗體滴度，其中以蜂膠佐劑苗的抗體滴度最高。45d后抗體滴度均有所下降，但以蜂膠佐劑苗的抗體滴度下降最慢。據報道，蜂膠佐劑苗在免疫30d后抗體滴度高達211，幾乎是組織滅活苗抗體滴度的2倍，且還有上升趨勢。表明蜂膠佐劑滅活苗的抗體滴度高于其他2種疫苗，這與蜂膠既能促進機體對抗原產生特異性免疫反應，又能啟動機體非特異性免疫反應有關。由此可見，蜂膠佐劑滅活苗吸收快，產生效價高而持久，是值得推廣的新型疫苗。組織滅活苗中的抗原成分在短時間內即能被組織大量吸收，產生較高水平的抗體。鋁膠佐劑滅活苗由于抗原成分釋放緩慢，產生高水平抗體所需的時間較長。

3.2 從攻毒保護試驗來看，3種疫苗均能有效抵抗兔出血癥強毒的攻擊。免疫后7d，鋁膠佐劑滅活苗的抗體滴度最低，為26.5，但攻毒后試驗兔均能成活，而非免疫對照組全部死亡，說明26.5抗體滴度已能有效抵抗兔出血癥強毒的攻擊。免疫后150d攻毒，免疫組試驗兔雖有不同程度的死亡，但以組織滅活苗組的死亡率最高，達75%，蜂膠佐劑滅活苗組死亡率最低，達25%。表明組織滅活苗的免疫期較佐劑疫苗短，而蜂膠佐劑滅活苗的免疫期較長。據報道，兔出血癥滅活苗的免疫期為4～6個月，合理攻毒試驗應在免疫后10d內或4個月后，這樣才能更好地看出不同佐劑疫苗在保護率方面的差異。

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