一株副溶血弧菌噬菌體VPp1的分離鑒定及裂解性能

彭 勇, 丁云娟, 林 洪, 王靜雪

(中國海洋大學 食品科學與工程學院 食品安全實驗室, 山東 青島 266003)

一株副溶血弧菌噬菌體VPp1的分離鑒定及裂解性能

彭 勇, 丁云娟, 林 洪, 王靜雪

(中國海洋大學 食品科學與工程學院 食品安全實驗室, 山東 青島 266003)

為探究副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的生物防治方法, 從水產品市場處污水中分離出一株副溶血弧菌噬菌體VPp1。并借助噬菌斑形態、電鏡、酶切等技術對其進行了分類鑒定, 同時測定了其裂解譜、最佳感染復數、一步生長曲線以研究其裂解性能。分類鑒定結果表明, 其核酸是線型雙鏈DNA, 大小在15 kb左右。具有一個正二十面體的頭部, 頭部直徑大約為44 nm, 無尾, 屬蓋噬菌體科(Tectivirus); 裂解性能研究結果表明, 其在雙層平板上培養 12 h可形成中心清亮的噬菌斑, 周圍有大而明顯的暈環。最佳感染復數為0.0001, 潛伏期為10 min, 裂解量為90.3, 是符合條件的潛伏期短裂解量大的理想噬菌體, 可用作進一步的應用。

噬菌體; 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus); 鑒定; 裂解性能

弧菌病是由弧菌屬(Vibriosis)細菌引起的一類細菌性疾病, 已成為海水養殖業的主要病癥之一, 該病發病迅速、流行范圍廣、致病性強, 給國家和企業造成了巨大的經濟損失。目前, 國內外已經報道的弧菌病病原主要有副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、創傷弧菌(Vibrio vulnificus)和河弧菌(Vibrio fluvialis)等[1]。副溶血弧菌的主要感染對象是對蝦、海水魚類、文蛤、牡蠣等, 能引起海洋動物體表發炎、充血等癥狀,感染蟹類、貝類會引起大量死亡[2]。人體食用被感染的食品會引起腹痛、嘔吐、腹瀉、腸痙攣、惡心和發燒等典型胃腸炎反應[3]。

目前, 弧菌病的防治方法主要是抗菌藥物防治,同時還有免疫防治、生物防治等[1]?？咕幬锏拇罅渴褂貌粌H污染了養殖環境, 還導致了致病菌耐藥性不斷增強及養殖動物抗病能力的下降。免疫防治的研究剛剛起步, 疫苗的研制大多數為福爾馬林滅活的全細胞疫苗, 減毒疫苗還缺乏安全性保障, 商品化生產還未開始。生物防治可大量減少抗菌素及殺蟲劑的使用量, 保護生態環境, 降低病源微生物抗藥性的產生。作為一種安全、綠色的治療方法, 已經越來越受到人們的關注, 具有廣泛的推廣和應用前景。

噬菌體(Bacteriophage)是感染細菌和放線菌的病毒, 是生物防治的主要手段[4]。噬菌體分為烈性噬菌體和溫和噬菌體兩類, 烈性噬菌體可以通過酶的作用破壞細胞壁, 專一性裂解宿主菌。本研究從水產品交易市場的污水中分離出一株副溶血弧菌噬菌體,在雙層平板上培養12 h出現了清晰的噬菌斑, 屬烈性噬菌體。并對其進行了初步的分類鑒定及裂解性能的研究, 為其代替抗生素應用于副溶血弧菌引起的弧菌病的治療奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

分離噬菌體使用的菌種為Vibrio parahaemolyticus17802 (以下簡稱VP 17802), 最初由Fujino[5]等于1953年從日本一個食物中毒患者體內初次分離得到。購自美國典型微生物菌種保藏中心 (American type culture collection, ATCC)。

測定噬菌體裂解譜使用的V. parahaemolyticus菌株VP VIB304、VP VIB461、VP VIB800來自中國海洋大學應用微生物實驗室; VP 17802(sj)、F3-3來自山東出入境檢驗檢疫技術中心; qdfsVp001由中國海洋大學食品安全實驗室分離自青島周邊海水, 并經過生理生化特性測定及16SrDNA序列測定鑒定為一株新的副溶血弧菌。

1.1.2 培養基

2216E培養基, 購自青島高科園海博生物技術有限公司。

1.1.3 SM緩沖液

5.8 g NaCl, 2 g MgSO4·7H2O, 50 mL的1 mol/L pH 7.5 Tris-HCl, 加蒸餾水至1 000 mL, 滅菌備用。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體的分離

從青島南山水產品市場處采集商販暫養海產品的海水及污水樣品 4份并編號, 取青島第一海水浴場岸邊海水一份。取上述樣品30 mL加入到50 mL的離心管中經5 000 r/min, 10 min離心, 取上清液5 mL加入5 mL 2倍濃度2216E液體培養基中, 同時加入100 μL對數期的VP 17802(OD600= 0.837), 37°C過夜培養。次日, 經5 000 r/min, 10 min離心, 取上清液過0.22 μm的微孔濾膜, 得到噬菌體原液, 4°C冰箱保存。

采用雙層平板法, 用滅菌的 SM 緩沖液對噬菌體原液進行適當稀釋, 將 100 μL對數期的 VP 17802(OD600= 0.837)與100 μL的噬菌體稀釋液分別加入5 mL的2216E半固體培養基中, 混勻, 倒入事先制好的2216E固體瓊脂上, 制成雙層平板。待凝固后倒置, 并于37℃恒溫箱中培養。

1.2.2 噬菌體的純化

方法進行噬菌體純化[6], 具體步驟為:用接種針從上述出現噬菌斑單斑的雙層平板上挑取一個單斑到1 mL的SM 緩沖液中, 混勻, 4°C冰箱過夜。次日, 用滅菌的SM緩沖液將上述噬菌體液進行適當稀釋, 取100 μL的噬菌體稀釋液與100 μL對數期的VP 17802(OD600= 0.837)混合, 37 °C恒溫放置30 min, 再與5 mL半固體培養基混勻倒入事先制好的固體瓊脂平板上制成雙層平板, 待凝固后倒置,并于37 °C恒溫箱中培養。重復雙層平板純化操作5次得到生物學純的噬菌體株系。

1.2.3 噬菌斑的形態觀察

將各株噬菌體分別用SM 緩沖液進行適當稀釋,取合適稀釋度噬菌體液用雙層平板法做單斑培養,觀察各株噬菌體的噬菌斑特征。

1.2.4 噬菌體增殖液的制備

本研究采用固體增殖法, 選取合適稀釋度的長有噬菌斑的雙層瓊脂平板, 加入10 mL SM緩沖液, 4°C冰箱放置過夜。次日, 8 000 r/min, 15 min離心,取上清液過0.22 μm的微孔濾膜, 得到噬菌體增殖液, 4°C冰箱保存。

1.2.5 噬菌體核酸的提取

取效價達到 109pfu/mL以上的噬菌體增殖液1 mL經 12 000 r/min離心59 min (室溫), 吸去上清,收集噬菌體顆粒, 然后采用 UNIP-10柱式細菌基因組提取試劑盒 (上海生工) 提取噬菌體的核酸。所提取的噬菌體核酸溶液置于–20℃保存。瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取結果。

1.2.6 噬菌體核酸類型的鑒定

取上述噬菌體的核酸溶液, 用DNaseI、RNaseA及Mung Bean Nuclease 進行酶切實驗, 瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結果。

1.2.7 噬菌體的電鏡觀察

采用磷鎢酸負染法[7-8], 方法如下: 取 20 μL效價達1010pfu/mL的噬菌體液, 滴在銅網上, 自然沉淀2～3 min, 用濾紙從側面吸去多余液體, 在銅網上加一滴2%的磷鎢酸, 染色10 min, 用濾紙從側面吸取染液, 干燥后進行電鏡觀察并拍照。

1.2.8 噬菌體裂解譜的測定

采用雙層平板法, 取100 μL的噬菌體稀釋液與100 μL對數期的副溶血弧菌(OD600= 0.837)混合, 37℃恒溫放置30 min, 再與5 mL半固體培養基混勻倒入事先制好的固體瓊脂平板上制成雙層平板, 待凝固后倒置, 并于37℃恒溫箱中培養。根據噬菌體的效價, 選擇形成 30～300個噬菌斑的稀釋度來分析 VPp1對 VP 17802(sj)、F3-3、VP VIB304、VP VIB461、VP VIB800、qdfsVp001 菌株的裂解情況。

1.2.9 噬菌體最佳感染復數(MOI值)的測定

按照感染復數分別為10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01、0.000 001的比例, 分別將100 μL噬菌體與100 μL VP 17802 ( 3×107CFU/mL )加入10 mL 2216E液體培養基中, 37 °C振蕩培養10 h, 4000 r/min離心15 min去除菌體, 去掉沉淀, 上清液用0.22 μm的膜過濾, 用雙層平板法測定噬菌體的效價, 效價最高的感染復數為最佳感染復數。

1.2.10 噬菌體一步生長曲線的測定

一步生長曲線的測定參照杜崇濤[9]的方法。分別將 1 mL 噬菌體和 1 mL對數生長期的 VP 17802 (OD600= 0.837)按照感染復數為10的比例加入到8 mL 2216E液體培養基中, 37 °C孵育5 min, 12 000 r/min離心30 s, 棄上清, 用2216E液體培養基洗滌兩次。加入等體積37 °C預熱2216E液體培養基并充分混勻, 迅速置于37 °C振蕩培養, 同時開始計時, 前30 min內每5 min取一次樣, 以后每10 min取一次樣,測定噬菌體的效價。以感染時間為橫坐標, 噬菌體的效價為縱坐標, 繪制一步生長曲線。

2 結果

2.1 噬菌體的分離、純化及噬菌斑的形態觀察

從青島市南山水產市場的污水中分離出了一株噬菌體VPp1, 通過雙層平板37°C培養12 h發現, VP 17802被侵染, 出現了大量的噬菌斑 (圖1)。純化得到的噬菌斑呈圓形, 中心清亮, 邊緣有大而明顯的暈環, 純化后的噬菌體經固體增殖后效價可達到1010pfu/mL以上。

圖1 副溶血弧菌噬菌體噬菌斑的形態Fig. 1 The bacteriophage plaque of phage VPp1

2.2 噬菌體核酸的提取

瓊脂糖凝膠電泳圖(圖2)顯示, 提取的噬菌體核酸純度較好, 濃度較高, 條帶完整。通過Quantity One 軟件分析得噬菌體VPp1的核酸分子量為15738.77 bp。

2.3 噬菌體核酸類型的鑒定

圖2 副溶血弧菌噬菌體的核酸Fig. 2 The nucleic acid of phage VPp1

圖3 副溶血弧菌噬菌體核酸類型的判斷Fig. 3 Determination of the nucleic acid type of bacteriophage

瓊脂糖凝膠電泳圖(圖3)顯示, 噬菌體能被DNaseI降解, 而不能被RNaseA降解, 說明各噬菌體的核酸是 DNA, 而不是 RNA。電泳只有一條條帶,說明噬菌體核酸是線型的。不能被 Mung Bean Nuclease降解, 說明噬菌體核酸是雙鏈的而不是單鏈的。綜合3種酶的酶切結果表明, 本實驗分離的株噬菌體的核酸是線型雙鏈DNA。

2.4 噬菌體的電鏡觀察

噬菌體在透射電子顯微鏡下的形態圖(圖4)顯示,噬菌體VPp1有一個呈正六邊形的頭部, 推測是正廿面體結構, 頭部直徑大約為44 nm。無尾。根據ICTV第八次報告的最新病毒分類系統的標準[10], 該噬菌體屬于蓋噬菌體科(Tectivirus)。

圖4 副溶血弧菌噬菌體VPp1的電鏡照片 (×100000) Fig. 4 Electron micrograph of phage VPp1

2.5 噬菌體裂解譜的測定

2.6 噬菌體最佳感染復數(MOI值)的測定

噬菌體最佳感染復數的測定結果分別見表1。

從表1中數據可看出, 當感染復數從10一直降到 0.0001時, 噬菌體的效價一直在升高, 當感染復數再降低時, 噬菌體效價開始降低, 即當感染復數為0.0001時, 噬菌體效價達到最高值2.62±0.03×1010,所以噬菌體VPp1的最佳感染復數為0.0001。

2.7 噬菌體一步生長曲線的測定

噬菌體 VPp1的一步生長曲線測定結果分別見圖5。

據圖5, 可以明顯看出噬菌體VPp1感染宿主菌后10 min內, 噬菌體的量沒有增加, 即潛伏期約10 min; 噬菌體感染宿主菌后 10～30 min, 噬菌體的量急速增加, 即噬菌體 VPp1的裂解期約 20 min; 在隨后的90 min里, 噬菌體的量變化不大, 即噬菌體進入到穩定期。根據裂解量計算公式: 裂解量=裂解末期噬菌體效價/感染初期宿主菌濃度=2.71×109/3× 107=90.3。

表1 噬菌體VPp1最佳感染復數的測定Tab. 1 Determination of bacteriophage VPp1 MOI

圖5 噬菌體VPp1的一步生長曲線Fig. 5 One-step growth curve of phage VPp1

3 討論

本研究曾于4、5月份進行過多次噬菌體的分離,均一無所獲。6月初的一次分離成功地分離出大量噬菌體, 這說明氣溫對噬菌體分離的成功與否有很大影響, 原因可能是氣溫低時水體中宿主菌的含量極少, 致使噬菌體含量極少, 所以很難分離出來。藺紅蘋[11]等的研究也提到過類似的情況。另外, 楊吉霞[12]在研究中提到從赤潮海水中分離噬菌體會更容易,原因是赤潮海水藻類爆發性增殖, 而藻類與細菌、病毒之間存在著相生相克、錯綜復雜的互相作用, 藻類增殖后, 細菌、病毒的數量也會隨之改變。這也許不失為一個好辦法。

目前國際上噬菌體的分類標準尚不完善, 2005年國際病毒分類委員會 (ICTV) 第八次報告將噬菌體進行了比較系統的分類與命名。其依據核酸類型、形態結構、基本特性及宿主菌類型等特征將噬菌體劃分為群、目、科、屬、種5個階級, 種下根據實際需要可設立亞種[13]。本研究分離出的噬菌體核酸是線型雙鏈 DNA, 根據第八次報告的分類方法, 應首先劃分為群I。噬菌體無尾, 根據其形態特征可劃分為蓋病毒科蓋噬菌體屬。

阿花的淚又滾落在白凈的臉上。我對誰都沒說過，為了生存，為了打拼，我不得不掩飾自己，不得不虛與委蛇。其實在南方，很多人不得不這樣來掩飾自己，假身份證，假文憑，假夫妻，假城里人，假洋鬼子……比比皆是。我隱瞞那段歷史，是怕你們看不起我，是怕失去做女人的優勢，是怕在商場難以立足。

噬菌體裂解譜測定結果顯示, 本研究提取的副溶血弧菌噬菌體的裂解譜范圍并不廣泛, 但其能形成透亮的噬菌斑, 說明其均有很強的裂解能力。另外,多方面的研究已表明[14], 雖然噬菌體對宿主菌有高度特異性, 但通過人工改造, 可以擴展噬菌體的裂解范圍。本實驗提取的噬菌體有待于用各種方法擴展其宿主譜, 為其在致病菌檢測方面的應用奠定基礎。

感染復數, 又稱感染倍數, 是為研究病毒感染與產出之間量效關系而提出的一個重要生物學指標[15]。噬菌體的感染復數是指初始感染時, 加入噬菌體的數量與加入宿主菌數量的比值。不同的噬菌體的感染復數是不同的, 存在一個最佳用量和最大產出問題, 即最佳感染復數。最佳感染復數與噬菌體的種類、結構以及宿主菌有關, 最佳感染復數反映了噬菌體的裂解能力。本研究分離的噬菌體VPp1的最佳感染復數分別為 0.0001, 邱德全[16]等分離的副溶血弧菌噬菌體最佳感染復數在0.1～10, Onanong[17]等測得食竇魏斯氏菌噬菌體感染宿主菌的最佳感染復數在0.01, 與之相比較, 可知噬菌體VPp1具有較強的裂解能力。

一步生長曲線可反映噬菌體 3個重要的特征參數: 潛伏期、裂解期、裂解量?？蔀槭删w的治療、檢測等應用研究篩選出潛伏期短裂解量大的噬菌體。本研究分離的噬菌體VPp1的潛伏期較短, 裂解量達 90.3, 表明其裂解能力是非常強的, 可進一步應用于噬菌體治療、檢測等方面。

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(本文編輯: 譚雪靜)

Isolation, identification and lysis properties analysis of aVibrio parahaemolyticusphage VPp1

PENG Yong, DING Yun-juan, LIN Hong, WANG Jing-xue
(Food Safety Laboratory, College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao, 266003, China)

Dec.,2, 2011

phage;Vibrio parahaemolyticus; identification; lysis properties

In order to develop an effective bio-controlling method againstVibrio parahaemolyticus, a virulent phage VPp1 was isolated from aquatic sewage water and identified by plaque shapes, restriction, electronic microscope and lysis properties analyses. The results revealed that VPp1 contains a linear double stranded DNA with 15kb in size and it has an icosahedral head with 44 nm in diameter and does not have a tail, suggesting that VPp1 belongs to theTectivirusfamily. VPp1 forms plaques with transparent center and large halo after culture in double-layer agar plate for 12 hours and its optimum MOI value was 0.0001. A one-step growth experiment showed that the latent period and burst size were estimated at 10 min and 90.3 phage particles/infected cell, respectively. VPp1 could be widely used because of its short latent period and large burst size.

Q939.48

A

1000-3096(2013)01-0096-06

2011-12-02;

2012-03-25

國家自然科學基金資助項目(31071540); 現代農業產業技術體系建設專項資金資助項目(nycytx-50); 山東省自然科學基金資助項目(ZR2011CQ024)

彭勇(1987-), 男, 山東濰坊人, 碩士研究生, 主要從事食品質量與安全方面研究, 電 話: 0532-82031550, E-mail: pengyongpy520@163.com; 王靜雪, 通信作者,電話: 0532-82032389, E-mail: snow@ouc.edu.cn