G蛋白偶聯受體激酶4突變A142V基因對大鼠血管平滑肌細胞AT1受體的影響＊

鄧 昆，劉 莉，陳彩宇，陳 墾，王 微，周永巧，何多芬，曾春雨△

（1.第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所心血管內科／重慶心血管病研究所，重慶400042；2.77263部隊醫院，云南大理671000）

原發性高血壓（esesntalihypertension，EH）是冠心病、糖尿病腎病以及腦梗死等的重要危險因素。EH的發生和遺傳因素密切相關，與EH基因連鎖的G蛋白偶聯受體激酶4（GRK4）也因此受到越來越多的關注。GRK4是GRKs的一種，在GRKs的幾個亞型中，只有GRK4的改變先于高血壓的發生而發生［1-2］，其變異體A142V和EH的發生密切相關［3］。腎素血管緊張素（RAS）系統激活參與動脈粥樣硬化的形成，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是整個RAS系統最重要的因子之一，血管緊張素Ⅱ1型（AT1）受體是AngⅡ的主要作用受體，其介導的血管平滑肌細胞（VMSCs）增殖是動脈粥樣硬化、術后血管再狹窄共同的病理基礎［4］。既往的研究發現轉染GRK4γA142V基因的小鼠GRK4升高的同時血壓明顯升高［1］，Yatabe等［5］發現在腎臟組織 AT1受體伴隨 GRK4的改變而發生改變，本實驗室以往研究發現人和大鼠的血管上有GRK4的表達，作者推測血管組織GRK4對AT1受體也有重要的調控作用。因此，本研究以轉染hGRK4γWT和hGRK4γA142V的A10細胞為研究對象，檢測這兩種細胞中AT1受體的改變和細胞增殖的變化，以探索hGRK4γA142V如何影響RAS系統而引起VSMCs異常增殖導致EH的發生。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠胸主動脈平滑肌細胞株（A10），hGRK4γWT和hGRK4γA142V質粒由美國馬里蘭大學Dr Pedro A Jose實驗室惠贈，DMEM高糖型培養基，FBS胎牛血清購自美國GIBCO公司；AngⅡ購自美國Sigma公司；GRK4活性測定試劑盒購自上海杰美公司；兔抗AT1R、兔抗β-actin一抗購自美國Santa Cruz公司；磷酸化蘇氨酸抗體購自美國cell signaling technology公司；［3H］胸腺嘧啶試劑盒購自北京原子能研究所。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒載體的構建、病毒的生產包裝及轉染 將hGRK4γWT質粒、hGRK4γA142V質粒和綠色熒光蛋白（EGFP）基因克隆至慢病毒表達載體，利用lipofectamineTM2000脂質體轉染試劑將慢病毒包裝質粒混合物與包含hGRK4γWT、hGRK4γA142V的表達載體共轉染至病毒生產細胞系293TN，48h后收集上清液，使用0.45μm濾膜過濾上清液，由此包裝、生產出攜帶GRK4γWT、GRK4γA142V基因的重組慢病毒 （Lv-GRK4γWT-EGFP 和 Lv-GRK4γA142V-EGFP），收集上清液，以MOI值為10感染A10細胞。

1.2.2 熒光共聚焦顯微鏡下觀察EGFP表達 hGRK4γWT和hGRK4γA142V細胞均勻接種于6孔培養板中（內置蓋玻片），置37℃5%CO2培養箱中培養至第3天，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗滌3次，取細胞爬片置熒光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.3 免疫印跡檢測AT1受體 常規方法提取細胞總蛋白，采用考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度。將50μg變性好的蛋白進行SDS-PAGE電泳，利用半干轉移法將蛋白轉移至硝酸纖維素膜，封閉1h，與GRK4抗體，AT1受體抗體（1∶400）4℃孵育過夜，TBST洗滌3次×10min，羊抗兔IgG（1∶5 000）室溫孵育1h，TBST洗滌3次×10min，利用增敏化學發光法，經X線片曝光、顯影、定影。結果經光密度面積分析，與內參照β-actin產物條帶的比值作為相對濃度。

1.2.4 分光光度法檢測GRK4活性 提取細胞總蛋白，采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。65μL緩沖液，10μL酶促液，10 μL反應液，10μL底物液于30℃培養箱里靜置3min，加入50 μg蛋白，陰性對照加入5μL陰性液作為背景對照，用分光光度法測定，以每微克總蛋白中GRK4每分鐘NADH轉化為NAD的量表示。

1.2.5 ［3H］胸腺嘧啶的摻入試驗將hGRK4γWT 和hGRK4γA142V細胞制成單細胞懸液，計數后將細胞濃度調整為3×104個／mL，按1mL／孔接種于24孔培養板，置37℃、5%CO2培養箱中培養48h，然后換等量的無血清培養液培養2h，然后向每孔中加入［3H］胸腺嘧啶0.3mCi繼續培養6h，吸去含游離［3H］胸腺嘧啶的培養液，用0.25%胰酶消化細胞，真空抽濾法將細胞收集于玻璃纖維濾膜，依次用PBS、10%三氯乙酸及無水乙醇沖洗，抽干后于80℃、30min烤干，置液閃杯中，加入5mL液體閃爍液，靜置平衡過夜，在液閃儀上計數每分鐘的值，以3×104細胞表示［3H］胸腺嘧啶的摻入率［4，6］。

1.3 統計學處理 采用SPSS15.0軟件分析。計量資料以±s表示，兩組間采用t檢驗，兩組以上的比較采用ANOVA法進行統計分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 hGRK4γWT和hGRK4γA142V轉基因細胞的建立及蛋白鑒定 構建了野生型GRK4wild-IRES2-EGFP表達載體和突變體GRK4A142V-IRES2-EGFP表達載體，慢病毒以MOI值為10感染A10細胞。熒光顯微鏡下觀察，兩種細胞均可見90%細胞細胞質內表達EGFP，呈綠色熒光，提示病毒成功轉染細胞，攜帶基因的蛋白表達。見圖1。

圖1 熒光顯微鏡下觀察轉染細胞的綠色熒光（×200）

2.2 hGRK4γA142V轉基因細胞GRK4活性的改變 結果顯示，hGRK4γA142V細胞的GRK4酶活性顯著升高。見圖2。

圖2 hGRK4γA142V轉染A10細胞GRK4活性的改變

2.3 hGRK4γA142V轉基因細胞AT1受體的改變 免疫印跡顯示A10細胞轉染hGRK4γA142V基因后，AT1受體表達顯著升高。見圖3。

圖3 hGRK4γA142V轉染A10細胞AT1受體表達的改變

2.4 hGRK4γA142V轉基因細胞GRK4和AT1受體共連接的改變 免疫沉淀顯示，GRK4和AT1受體間存在共連接作用，hGRK4γA142V轉基因細胞GRK4和AT1受體的共連接作用明顯減弱，這種共連接的改變可能參與了GRK4對AT1受體的調節作用。見圖4。

圖4 hGRK4γA142V轉基因細胞GRK4和AT1共連接的改變

2.5 AngⅡ刺激轉染hGRK4γA142V轉基因細胞增殖效應的改變 采用［3H］胸腺嘧啶摻入法測定細胞增殖，結果顯示AngⅡ刺激hGRK4γA142V細胞引起細胞增殖幅度明顯高于刺激hGRK4γWT細胞，見圖5。

圖5 AngⅡ刺激hGRK4γA142V轉基因細胞引起增殖效應改變

3 討 論

RAS在調節血管張力及鈉水平衡方面發揮了重要作用。AngⅡ作為RAS系統中最主要的生物活性物質，其和AT1受體結合后介導了細胞增殖、腎近曲小管細胞尿鈉轉運，與AT2受體結合則發揮相反的作用。高血壓狀態下AT1受體的功能增加，其發生的原因目前尚不明了。GRKs是一種絲氨酸／蘇氨酸激酶，共7個亞型，其主要生理功能是磷酸化GPCR，使GPCR介導的信號通路失敏，在這7個亞型中只有GRK4的改變先于高血壓的發生。GRK4基因所在的染色體部位（4p16.3）與EH的發生關系密切，其基因變異體也和EH的發生密切相關［6］。人的 GRK4有α、β、γ、δ4種異構體，γ異構體的3個突變位點A142V、A486V、R65L可以引起GRK4活性升高和EH密切相關，所以γ亞基成為本研究關注的焦點［7］。Jose等［8］發現在3個突變體中只有A142V轉基因小鼠在正常鹽飲食的情況下可以發生高血壓，他們還發現在攜帶A142V突變基因的日本高血壓患者中，服用血管緊張素受體阻斷劑（ARB），血壓出現顯著性降低，A142V轉基因小鼠服用ARB后血壓恢復正常。這提示GRK4γA142V突變引起的血壓升高和RAS系統及AT1受體有密切聯系。

既往研究發現人的GRK4存在于睪丸、腎臟和腦組織中［9］，而本實驗室首次發現VSMCs中有GRK4表達。在腎臟組織GRK4和AT1受體有密切關系，那么在血管組織中，GRK4是否也調節AT1受體的表達及其介導的平滑肌細胞增殖。本研究轉染hGRK4γA142V到 A10細胞中，觀察到GRK4活性顯著升高，這種現象證實hGRK4γA142V可以使GRK4的活性增強。AT1受體作為GPCRs的一種，Zheng等［10］發現hGRK4γA142V轉基因小鼠腎臟AT1受體表達升高，在血管中，GRK4是否具有相同的效應，本研究結果顯示hGRK4γA142V細胞中AT1受體的表達顯著升高。推測這種活性的增強引起的AT1受體表達的改變參與了高血壓的發生、發展。作者還發現轉染hGRK4γA142V可導致GRK4和AT1受體的共連接降低，推測GRK4和AT1受體的共連接程度減少導致GRK4和AT1受體偶聯減少，而這種偶聯的減少可能與AT1受體磷酸化的改變相關。

據以往報道，AT1受體具有自發活性，當AngⅡ刺激時AT1受體的活性明顯增強［11-12］，在血管中AT1受體介導的VSMCs的異常增殖是血管壁增厚和硬化的主要病理、生理基礎［13］。本研究結果顯示，AngⅡ刺激后轉染hGRK4γA142V細胞的增殖效應明顯高于轉染hGRK4γWT細胞，在沒有AngⅡ刺激的狀態下轉染hGRK4γA142V細胞的增殖效應仍然明顯高于轉染hGRK4γWT細胞。

綜上所述，hGRK4γA142V通過影響的VSMCs AT1受體表達，從而影響AT1受體介導的VSMCs增殖，在心血管系統疾病的病理、生理過程中具有重要意義。

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