提高淋巴結病理切片質量的體會

宋 容，肖 覺

（重慶市腫瘤研究所病理科 400030）

淋巴結切片常規HE染色的制片方法一直是病理技術的難題［1］，其原因除淋巴結病變本身的復雜性外，主要還是由于切片質量較差所致。質量差的淋巴結切片比其他組織更容易造成假象而導致誤診。淋巴結病理診斷誤診率高達10%～30%，其中切片因素占多數［2］。淋巴結切片的制片必須遵循“薄切、淡染”的原則。按常規方法難以制作出優質淋巴結切片，為了克服淋巴結制片時經常出現裂痕、皺褶、破碎，染色過深或過淺等問題。作者經過多年的臨床實踐，總結出了一些優質淋巴結切片的制片經驗和體會，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 本院2011年1月至2012年12月淋巴結活檢標本50例。

1.2 試劑 改進的B-5固定液［3］［（1）1%鞣酸1mL；（2）95%乙醇加8g水楊酸80mL；（3）甲醛15mL，3種液體混合配制成100mL后，取B-5液66mL加入甲醇480mL和氯仿240 mL混合，再加入醋酸80mL］。蘇木精（hematoxylin）染色液、伊紅（eosin）染色液、乙醇、硬脂酸、石蠟、0.5%～1.0%鹽酸乙醇、二甲苯。

1.3 方法

1.3.1 固定 改進前常規淋巴結組織標本采用10%甲醛固定液，改進后淋巴結標本采用改進的B-5固定液。

1.3.2 取材 淋巴結取材大小1.0cm×1.0cm×0.3cm，取材要規范，取材刀要鋒利，避免組織擠壓，發生嚴重變性。

1.3.3 脫水 選用乙醇脫水效果最佳，從低濃度到高濃度乙醇脫水，脫水要徹底，脫水時間要嚴格控制。

1.3.4 透明及浸蠟 改進前用二甲苯透明劑石蠟浸蠟，改進后用硬脂酸和石蠟的混合液替代二甲苯透明劑。

1.3.5 包埋切片 硬蠟包埋，切片厚度2.5～3.0μm為宜，裱片，展片，烤片。

1.3.6 染色 蘇木精染液染色時間短，流水沖洗，0.5%～1.0%鹽酸乙醇分化，熱水返藍，伊紅染色數秒，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2 結 果

對50例淋巴結活檢標本HE切片的制片技術進行改進，獲得了良好效果。與舊方法相比，采用該方法制作淋巴結切片，組織結構形態更完整，切片無皺褶，無刀痕，厚薄均勻，組織無擠壓。鏡下折光率強、胞質胞核著色分明，淋巴結結構清晰，皮質、髓質充分展現，淋巴濾泡清晰，色彩艷麗，均勻一致，核膜及核仁結構清楚［4］，核槳對比鮮明。制片優良率達到95%以上（圖1、2）。

圖1 改進前的淋巴結切片（HE×200）

圖2 改進后的淋巴結切片（HE×200）

3 討 論

淋巴結組織結構致密，細胞豐富，間質少，外周又有一層致密的纖維結締被膜［5］。按常規病理制片技術操作過程，如標本取材、固定、脫水、透明和浸蠟到切片、染色等方法很難制作優質的淋巴結切片。應用改進后方法制作淋巴結HE切片，組織結構更清晰，色彩和對比度都優于常規切片，給病理診斷提供了可靠的保證，但是在制作淋巴結HE切片時必須注意以下環節。

3.1 避免組織損傷 組織損傷包括人為損傷、組織變干，組織損傷可由多個環節造成。人為損傷是由于病理技術人員在整個制片過程中操作不細心，造成切片劃痕等；組織變干是由于組織沒有及時固定或組織沒有完全浸泡在固定液中，致使組織發生干縮變硬。標本及時充分地固定是制作良好組織切片的基礎。標本離體后，無論大小均應立即固定，這是切片成功的關鍵。若組織固定不良，在以后的標本制備過程中則無法加以糾正，標本的固定液有幾種，臨床常用10%甲醛固定液和4%中性甲醛固定液，此種固定液配制方法簡單，為大多數病理科采用，但是用于短時間內很難滲透到淋巴組織內部，組織邊緣固定尚可，深部組織很難滲透進去，造成組織標本固定不均勻。采用加溫固定，可使蛋白質凝固，但會造成組織自溶。使用改進的B-5固定液固定淋巴結，其滲透力強，能迅速滲入組織內部，能凝固組織細胞內成分，使組織達到一定硬度，從而獲得較佳的折光率［6］。且其對染料具有較強的親和力，無色素沉著，染色前無需進行脫色素處理。同時又不會使組織過度收縮或膨脹，短時間即可達到固定作用，并且能支持免疫組織化學、原位雜交和特殊染色技術［7］，是淋巴結的理想的固定液。將活檢新鮮淋巴組織標本剖開，立即放入改進的B-5固定液培養瓶內。固定液的量是組織塊總體積的4～5倍［8］，固定時間3h左右，保證細胞不發生自溶和降解。

3.2 取材規范 取材要規范，淋巴結取材時，采用鋒利的刀、剪，刀刃宜薄，首先仔細剔除淋巴組織周圍的脂肪組織，切取組織刀要從刀根向后拉動切開組織，動作應輕柔不能用力擠壓組織，一刀切下避免重復，防止造成淋巴結中央凹陷或不完整，避免使用有齒鑷子。這是淋巴結取材中需特別注意的問題，標本大小以1.0cm×1.0cm×0.3cm為宜。若過厚固定不好，組織結構不佳，過薄切片張數有限，如用于讀片會的切片則難以滿足需要；組織脫水，用新鮮脫水劑，室溫下進行。加熱脫水易造成組織變硬和細胞收縮，脫水劑采用低濃度至高濃度乙醇脫水，脫水時可增加脫水梯度，以利于在高濃度乙醇和無水乙醇中將組織殘余水分除盡。脫水劑采用乙醇為佳，能置換組織中的水分，在淋巴結脫水與透明時，一般將固定好的組織塊，放入80%乙醇60min，95%乙醇Ⅰ60min，95%乙醇Ⅱ60min，無水乙醇Ⅰ30min，無水乙醇Ⅱ30min。嚴格掌握脫水時間，如脫水時間過短，影響下一步透明，脫水時間長，組織收縮變硬，難以切出理想切片。組織透明及浸蠟，常規的組織透明采用二甲苯，二甲苯使用不當很容易造成組織收縮、變脆和硬化，淋巴結組織更是如此。采用硬脂酸和石蠟的混合替代二甲苯進行處理，作為脫水劑和石蠟間的中介劑，因硬脂酸對組織具有軟化兼透明的作用，使用硬脂酸處理標本后，組織質地柔韌，這樣可以有效避免組織收縮、變脆和硬化，即使纖維成分較多的組織，也容易切出薄而完整的切片。具體方法是：組織經過無水乙醇浸畢后，用硬脂酸和石蠟的混合液替代二甲苯進行透明劑處理。直接浸入硬脂酸和石蠟混合液Ⅰ，其配制比例為3∶2，浸入時間1h，溫度56～58℃。然后浸入硬脂酸和石蠟混合液Ⅱ，其配制比例為2∶3，浸入時間1h，溫度56～58℃，注意石蠟要定期更換。包埋的要點是：先將熔化的石蠟倒入包埋框，用加溫的鑷子輕輕夾住組織塊放入包埋框內，用鑷子輕輕壓平組織塊，使組織塊平整放置，避免因鑷子用力擠壓而造成的人為破壞。包埋用蠟的熔點56～58℃為宜。將包埋后蠟塊稍凝固，再移入冷臺冷卻后，按報道更利于薄切［9］。

3.3 切片制作完整 切片制作要完整，切片刀要非常鋒利，最好使用一次性刀片，切片厚度2.5～3.0μm。修整蠟塊時，先粗約將蠟塊組織修平成最大面后，然后移動刀刃用不同的區段切片。切片刀刃必須保持完好和清潔，操作時用力輕柔適當，轉速均勻，避免切削時切片刀對蠟塊形成擠壓，導致組織切片比蠟塊顯著縮小，組織壓縮，細胞變形。切片刀鈍、角度太大或切片速度太快，致使切片不是被切出來的而是被刮下來的。切片動作太猛會造成搓衣板樣改變；漂烘儀的水溫控制在40～45℃為宜，水溫太高，造成組織切片擴散，形成人為裂隙，造成假象，容易誤診；溫度太低展片不充分，組織切片易皺褶，影響觀察。組織切片應在水中充分伸展后裱貼，還可將切片經30%的乙醇初展后，再用載玻片撈起放入展片箱展片更易展平。烤片溫度要適當，一般組織切片烤片多直接平放在50～55℃烤片機上10min，然后80℃電吹風2min左右為宜。溫度高、時間長，易發生組織“焦糊”現象。溫度低、時間短，切片太厚脫蠟不盡或染色過程中容易發生脫片；染色、封片要細心，蘇木精-伊紅染色是病理技術中最基本的方法，在病理技術中廣泛應用，必不可少。因淋巴結細胞核比較大，細胞質較少，與其他組織切片一起染色，容易使蘇木精深染，伊紅著色淺。淋巴結切片與其他組織切片分別進行染色，根據蘇木精成熟程度控制染色時間，蘇木精染色時間短，一般2～3min，染色過程中0.5%～1.0%鹽酸乙醇的分化是 HE染色成敗的關鍵［10］，分化時間必須嚴格掌握，一定要恰到好處，分化不足時切片會呈現一片藍染，同時會影響伊紅上色，使切片層次不清，影響觀察。分化過度時，可適當延長返藍時溫水的時間，返藍不足時，不可進行伊紅染色，否則會發生切片過于紅染，同樣影響觀察，蘇木精染色深淺和分化時間只能通過鏡下觀察來控制染色效果。

總之，淋巴結切片的制片是非常復雜細致的工作，在操作過程中每一環節都要求病理技術工作者規范操作，認真仔細對待，而且還要在實際操作過程中不斷摸索，總結經驗。只有這樣才能給病理診斷提供優質可靠的淋巴結切片，給正確的病理診斷提供有力的技術保障。

［1］何燕，馬恒輝，王璇，等.淋巴組織制片中常見問題與對策［J］.診斷病理學雜志，2011，18（2）：147-149.

［2］陳晨，楊曉靜，傅春燕.淋巴結制片的幾點探討［J］.醫學臨床研究，2007，11（11）：2005-2006.

［3］宋容.新配方B-5固定液在HE制片中的應用探討［J］.重慶醫學，2006，35（12）：1115-1116.

［4］姜冰，楊軍，彭長纓.淋巴結片子染色中蘇木精染色時間的探討［J］.診斷病理學雜志，2010，17（3）：238.

［5］王德田，羅玉鳳，曹金伶，等.如何制作精良的淋巴結組織切片［J］.診斷病理學雜志，2005，12（4）：314.

［6］王琳，何樂健.三種不同固定液固定淋巴結所制切片的比較［J］.臨床與實驗醫學雜志，2005，4（3）：170-171.

［7］Bancroft JD，Gamble M.周小鴿，劉勇，譯.組織學技術的理論與實踐［M］.北京：北京大學醫學出版社，2010：45-61.

［8］龔志錦，詹熔洲.病理組織制片和染色技術［M］.上海：上海科學技術出版社，1994：5.

［9］康源，劉衛平.淋巴結常規制片技術體會［J］.臨床與實驗病理學雜志，2008，24（2）：235-236.

［10］姜元慶.病理檢驗技術［M］.北京：人民衛生出版社，2002：54-60.