疏血通注射液對局灶性腦梗死大鼠缺血周圍區細胞凋亡和TLR4表達的影響

鐘藝華，李光勤，唐顯軍

（1.重慶市腫瘤研究所神經內科 400031；2.重慶醫科大學附屬第一醫院神經內科 400016）

近年來研究表明，Toll樣受體4（toll like receptor 4，TLR4）作為中樞神經系統固有免疫反應的模式識別受體，在腦缺血損傷亞急性期，不但能調節促炎癥介質的產生，還能通過誘導細胞凋亡維持神經損傷與保護之間的平衡［1］。疏血通注射液具有抗凝、促纖溶、細胞保護的多重作用，能多環節、多途徑、多靶點發揮抗腦缺血損傷作用。本研究通過觀察疏血通注射液對大鼠腦缺血損傷后細胞凋亡及TLR4表達的影響，探討其可能的神經保護機制。

1 材料和方法

1.1 動物分組 健康成年雄性SD大鼠56只，體質量230～280g（由重慶醫科大學動物中心提供）。用抽簽法將動物分為3組：假手術組（n＝8）、模型組（n＝24）、疏血通注射液（SXT）治療組（n＝24）；再根據缺血時間（即線栓法阻斷血管至取材的時間）隨機分為12、24、48h及72h共4個亞組。

1.2 藥品與試劑 疏血通注射液（牡丹江友博藥業有限公司，批號為1206199）；細胞凋亡檢測試劑盒、兔抗大鼠TLR4單克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒（Takara公司）；SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德生物技術公司）；DAB顯色試劑盒（北京中杉生物技術公司）。

1.3 動物模型制備與給藥 參照Longa等［2］的插線方法，采用線栓法制備大鼠右側大腦中動脈閉塞（MCAO）模型，假手術組操作步驟同模型組，但線栓只插入距離CCA分叉5mm處的ICA內。在大鼠麻醉蘇醒后，采用Longa等［2］的5分制評分標準進行評分，評分為1～3分的大鼠納入實驗。SXT治療組在造模成功后按照0.7mL／kg劑量對大鼠進行腹腔注射，12h和24h亞組：每天1次，持續1d；48h亞組：每天1次，持續2d；72h亞組：每天1次，持續3d；假手術組和模型組在相同時間點則給予等量生理鹽水替代。

1.4 標本制備 每個亞組中一半大鼠在各觀察時間點用3.5%水合氯醛（1mL／100g）進行深度麻醉，經左室灌注生理鹽水200 mL和4%多聚甲醛溶液（PFA）200mL進行內固定，斷頭取視交叉前后各2mm的腦組織進行石蠟包埋后作連續冠狀切片。每個腦組織共取片3套，分別進行HE染色、TUNEL和TLR4免疫組化染色。另一半大鼠則斷頭取腦，分離缺血周圍區殘存的大腦皮質，提取RNA進行RT-PCR檢測。

1.5 指標檢測

1.5.1 HE染色 標本切片常規脫蠟、水化、HE染色、封片、光鏡下觀察。

1.5.2 凋亡細胞表達檢測 標本切片常規脫蠟、水化，按照TUNEL試劑盒提供的實驗步驟進行操作，DAB顯色，光鏡下觀察到TUNEL陽性細胞表現為：細胞體積縮小，包膜發泡，核內染色質濃聚，細胞核內可見棕黃色的TUNEL反應產物。用圖像信號采集分析系統分別測量計數各亞組缺血周圍區陽性細胞高表達的部位中5個互不重疊視野（10×20倍）下的陽性細胞數，將所得平均值作為統計資料。

1.5.3 TLR4蛋白表達檢測 標本切片常規脫蠟、水化，按照SABC免疫組化試劑盒提供的實驗步驟進行操作，DAB顯色，光鏡下觀察到細胞質或細胞膜上中出現粗細不等的棕黃色顆粒為陽性細胞。用圖像信號采集分析系統分別測量計數各亞組中缺血周圍區皮層陽性細胞高表達部位中互不重疊的3個視野（10×40倍）下的陽性細胞數，將所得平均值作為統計資料。

1.5.4 TLR4mRNA表達檢測 按照Trizol試劑盒說明書提取缺血腦組織中的總RNA，用紫外分光光度計檢測RNA濃度。用反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA第一鏈：37℃孵育15min，85℃5s終止反應，滅活反轉錄酶。TLR4引物序列上游為5′-TAA ATG CCA ACT GGA ACA-3′，下游為5′-TCT GCT AAG AAG GCG ATA-3′（862bp）。內參采用GAPDH，上游為5′-GTG GAG TCT ACT GGC GTC TT-3′，下游為5′-ATC ATA CTT GGC AGG TTT CT-3′（483bp）。反應條件：94℃預變性3min，進入循環94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共進行35次循環，最后72℃延伸5 min。PCR產物在瓊脂糖凝膠上進行電泳，運用Quantity-one凝膠自動成像儀成像，以看家基因GAPDH為內對照進行質控和標化，測定TLR4／GAPDH的灰度比值作為TLR4mRNA的相對表達量。

1.6 統計學處理 應用SPSS18.0統計軟件進行統計學分析，正態分布數據采用±s表示，組間差異采用單因素方差分析，即F檢驗；其中兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HE染色結果 假手術組未見缺血梗死灶，皮層神經細胞排列整齊，層次分明，包膜完整，核仁清楚，無核固縮、核碎裂及核溶解，神經間質無水腫（圖1A）。模型組可見白色梗死灶，表現為組織結構疏松，間質水腫，呈海綿狀，有炎性細胞浸潤，神經細胞結構模糊，胞體縮小，胞核固縮，碎裂及溶解，胞質尼氏小體減少或消失（圖1B）。SXT治療組可見缺血壞死區范圍明顯縮小，皮層神經細胞結構清楚，胞體腫脹、核固縮、核碎裂及核溶解現象較模型組明顯減輕（圖1C）。

2.2 凋亡細胞表達結果 在假手術組中可見零星散在分布的凋亡細胞；模型組中可見大量凋亡細胞，以缺血灶邊緣區內側及皮層分布最明顯，呈簇狀分布，在缺血24h表達達到峰值后隨著缺血時間的延長，表達開始下降，但在各缺血時間點較假手術組仍維持高水平表達（P＜0.01）。SXT治療組中細胞凋亡表達情況與模型組基本一致，在缺血24h達到峰值后，在各對應時間點TUNEL陽性細胞表達均較模型組低，二者比較差異有統計學意義（P＜0.05）。并且，隨著治療時間的延長，SXT治療組中TUNEL陽性細胞表達呈進行性下降，與前一時間點比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.3 TLR4蛋白表達結果 假手術組中可見少量TLR4陽性細胞表達（圖2A）；在模型組中，TLR4蛋白在缺血12h表達逐漸增加，24h時達到高峰，顏色加深（P＜0.01）（圖2B）；隨著缺血時間延長，其表達逐漸下降，但與假手術組比較仍維持高位表達。SXT治療組在缺血24h后TLR4蛋白表達均較模型組下調，二者比較差異有統計學意義（P＜0.05）（圖2C）；隨著治療時間延長，與前一時間點比較，其表達呈下降趨勢（P＜0.05），見表2。

表1 各組大鼠不同缺血時間點凋亡細胞表達情況比較（±s）

表1 各組大鼠不同缺血時間點凋亡細胞表達情況比較（±s）

＊：P＜0.01，與假手術組比較；△：P＜0.05，與前一時間點比較；▲：P＜0.05，與模型組比較。

組別2.34±0.82 2.78±0.49 3.02±0.27 3.29±0.57模型組 32.48±0.24＊ 68.93±0.38＊△ 67.42±0.54＊ 65.32±0.37＊SXT治療組 31.89±0.68＊ 51.73±0.93＊△▲ 43.26±0.28＊△▲ 37.28±0.75 12h 24h 48h 72h假手術組＊△▲

表2 各組大鼠不同缺血時間點TLR4蛋白表達情況比較（±s）

表2 各組大鼠不同缺血時間點TLR4蛋白表達情況比較（±s）

＊：P＜0.01，與假手術組比較；△：P＜0.05，與前一時間點比較；▲：P＜0.05，與模型組比較。

組別1.05±0.24 1.32±0.39 1.83±0.13 1.89±0.18模型組 3.32±0.87 28.32±0.49＊△ 22.72±0.36＊△ 18.53±0.24＊△SXT治療組 3.02±0.42 21.07±0.29＊△▲ 16.72±0.38＊△▲ 15.32±0.75 12h 24h 48h 72h假手術組＊△▲

表3 各組大鼠不同缺血時間點TLR4mRNA表達情況比較（±s）

表3 各組大鼠不同缺血時間點TLR4mRNA表達情況比較（±s）

＊：P＜0.01，與假手術組比較；△：P＜0.05，與前一時間點比較；▲：P＜0.05，與模型組比較。

組別0.023模型組 0.582±0.027 1.124±0.038＊△ 1.012±0.046＊△ 0.823±0.047＊△SXT治療組 0.512±0.046 0.879±0.056＊△▲ 0.793±0.028＊△▲ 0.762±0.083 12h 24h 48h 72h假手術組 0.428±0.037 0.457±0.074 0.431±0.052 0.487±＊▲

圖1 各組HE染色情況

圖2 各組第24小時缺血周圍區大腦皮層TLR4蛋白表達（ABC×400）

圖3 各缺血時間點模型組大鼠TLR4mRNA表達

圖4 各缺血時間點SXT治療組大鼠TLR4mRNA表達

2.4 TLR4mRNA表達結果 在模型組中，TLR4mRNA在缺血12h后表達逐漸增強，24h達到峰值，48～72h表達有所下降，與假手術組比較仍維持高水平表達（P＜0.01），見圖3。在SXT治療組中，TLR4mRNA表達規律與模型組一致，在缺血24h后TLR4mRNA表達在各缺血時間點均較模型組低，二者比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表3、圖4。

3 討 論

腦缺血損傷是一個復雜的病理生理過程，可分為3個階段：急性期興奮毒性產生和血腦屏障破壞；亞急性期免疫炎癥反應和神經細胞凋亡；慢性期神經修復和再生。近年來研究表明，在亞急性期階段（缺血后數小時至數天），促炎癥介質的產生和釋放作為介導細胞凋亡的主要因素之一，能加重缺血半暗帶區神經細胞的損傷［3-4］。TLRs作為固有免疫反應關鍵的模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）之一，在誘導炎癥反應和炎癥介質產生中扮演著重要角色［5］。其中，TLR4主要表達在小膠質細胞，在神經元及星形膠質細胞中也有表達［6］。當腦缺血損傷釋放大量內源性激活物，TLR4能通過識別相應的配體誘導MyD88依賴和TRIF依賴的兩個信號通路觸發一系列級聯免疫炎癥反應，引起相關細胞因子和炎癥因子的表達，最終導致炎癥反應失控［7］。本實驗研究發現：TLR4基因水平和蛋白表達規律一致，模型組在缺血12h表達逐漸增強，24h達到峰值后逐漸回落，48～72h較假手術組仍然維持高位表達，其表達規律與國內外研究結果相符［8-9］，提示TLR4作為炎性損傷因子與缺血后腦損傷有關。TUNEL檢測結果顯示：模型組在缺血12h時陽性細胞表達明顯升高，24h達到高峰后有所減少，至72h仍高于假手術組。上述研究結果顯示TLR4表達與細胞凋亡達到高峰的時間基本一致，說明在腦缺血損傷亞急性期，由TLR4介導的炎癥信號通路的過度激活，能引起大量與腦損傷密切相關的炎性介質的釋放，并且可能通過誘導細胞凋亡加重腦組織損傷。這與Jung等［9］用革蘭陰性菌的脂多糖（LPS）作為外源性配體激活TLR4信號通路刺激試管內培養的鼠的小膠質細胞，導致細胞凋亡的結果相符，提示TLR4與細胞凋亡之間可能存在關聯。

TLR4作為啟動炎癥反應的跨膜蛋白受體之一，在非生物性炎癥損傷過程中發揮著重要作用。研究證實多種具有明確抗炎療效的中藥能以TLR4為作用靶點，通過抑制相關炎癥因子的釋放發揮抗炎效應。相關實驗研究［8，10］均以 MCAO大鼠為模型，分別采用黃芩苷、木犀草素和氧化苦參堿腹腔注射給藥，發現在缺血24h后TLR4表達都出現下調，腦梗死體積縮小和腦水腫減輕，提示中藥能通過抑制LPS介導的TLR4炎癥信號通路發揮神經保護作用。疏血通注射液是由水蛭和地龍兩味動物藥材按科學配方提取的復方中藥制劑，其有效成分為水蛭中的水蛭素和地龍中的蚓激酶。水蛭素作為凝血酶抑制劑具有強大的抗凝作用，而蚓激酶具有類纖溶酶原激活物（tPA）作用，能發揮很強的溶栓作用。動物實驗及臨床研究均證明該藥抗凝、溶栓作用顯著。本研究結果顯示：SXT治療組在缺血24h后，TUNEL陽性細胞、TLR4mRNA和蛋白表達在各時間點均較模型組降低；并且隨著治療時間的延長，TLR4蛋白及TUNEL陽性細胞表達均呈下降趨勢，說明疏血通注射液能使TLR4表達下調，抑制神經細胞凋亡，提示疏血通注射液可能通過抑制TLR4信號通路調節促炎癥介質的產生和神經細胞的凋亡，這可能是其發揮腦保護作用的機制之一。

綜上所述，本研究結果從分子水平證實了腦梗死亞急性期，在缺血周圍區存在細胞凋亡和免疫炎癥反應能加重腦缺血損傷。疏血通注射液可能通過抑制細胞凋亡和下調啟動炎癥免疫反應的上游核心因子TLR4的表達發揮神經保護作用，但該藥抗腦缺血損傷的具體作用機制還有待進一步研究論證。

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