基于Teflon／納米金的新型NO微傳感器制備及性能分析＊

吳汪澤，熊 濤，甘 甜，盧忠心，喬 治△

（1.湖北省武漢市中心醫院檢驗科 430014；2.武漢大學醫學院微生物教研室，武漢430071；3.信陽師范學院化學化工學院，河南信陽464000）

一氧化氮（nitric oxide，NO）是生物機體中一種重要的生物信息分子和效應分子［1］。它在舒張血管平滑肌、傳遞神經間信息、抑制血小板聚集、介導炎癥和免疫反應等生理和病理過程均發揮著重要的作用［2］。因此其準確檢測對NO作用機制的研究具有重要的意義。電化學方法是目前惟一能夠對生物體內NO釋放過程進行直接、實時、連續檢測的方法［3］。本實驗采用原位化學種子-生長技術，制備了一種基于納米金柱電極的NO電化學微傳感器，并通過修飾高分子材料Teflon膜，極大地提高了傳感器的選擇性和穩定性，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 MonoStat電化學工作站（美國DTI公司），AB204-E分析天平（瑞士 Mettler Toledo公司），QB-206旋轉搖床（海門其林貝爾儀器制造有限公司），DHG-9023A干燥箱（上海精宏儀器有限公司）。直徑為150μm的玻璃纖維（美國WPI公司），Teflon AF2400（美國DuPont公司），氯金酸、鹽酸羥胺、硼氫化鉀和檸檬酸鈉均購于中國醫藥集團上海化學試劑公司，其他試劑均為國產分析純，實驗用水為雙蒸水。

1.2 方法

1.2.1 NO標準溶液的制備 如文獻［4］所述。

1.2.2 納米金溶液的制備 將1mL 1%氯金酸溶于90mL雙蒸水中，攪拌1min后加入2mL 38.8mmol／L檸檬酸鈉溶液，攪拌1min。再加入1mL現配的0.075%硼氫化鉀溶液，攪拌5min，4℃避光保存［5］。

1.2.3 納米金柱的制備 將長度為1.5cm的玻璃纖維依次置于10mmol／L十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）溶液30℃浸泡1h、納米金溶液中4℃過夜；然后置于1.5mL雙蒸水中，加入20mL 0.2mol／L 氯金酸和10μL 0.2mol／L鹽酸羥胺，于搖床上旋轉30min后洗滌；重復以上操作4次后自然晾干，玻璃纖維表面呈金黃色，即制得納米金柱。

1.2.4 修飾電極的制備 用銀導電膠將細銅絲粘連到納米金柱的一端，然后用10μL移液器槍頭對其加以固定，并用環氧樹脂膠將兩端粘結封閉。將露出的納米金柱剪至長度為5 mm，即制得納米金修飾玻璃纖維電極。將電極在1%Teflon溶液中浸泡10s后，100℃烘烤2h，即制得NO微傳感器。

1.2.5 檢測方法 采用三電極系統：Ag／AgCl為參比電極，鉑絲為對電極和所制備的電極為工作電極。0.01mol／L磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH 7.2）作為底液，利用安培響應法對NO進行測定，考察該NO微傳感器對NO的電化學響應及其靈敏度、線性范圍、重現性和穩定性等。

2 結 果

2.1 納米金柱微電極上NO的電化學響應 加入360nmol／L的NO標準溶液，納米金柱微電極上的氧化峰電流很大（圖1曲線a），Teflon修飾后電極上的氧化峰電流減小（圖1曲線b）；Teflon修飾后電極的背景噪聲明顯減小，且背景基線顯著降低。由于納米金柱具有較大的有效表面積，為NO的電化學氧化提供更多的活性位點，因此納米金柱對NO的氧化有優異的電催化作用，見圖1。

圖1 不同修飾電極上NO的安培響應

2.2 NO微傳感器的性能分析 在10mL半密閉電解池中以5mL PBS作為底液，插入電極，在氮氣保護下，加入一定體積的NO標準溶液到底液中，利用安培響應法對NO進行測定。隨著NO標準溶液的連續加入，其氧化峰電流迅速增加并很快達到穩態，并與加入NO標準溶液的量呈正相關。在7.2 nmol／L至 11.7μmol／L范圍內呈良好的線性關系（r＝0.998），線性方程是I／nA＝15.028＋0.036CNO，檢出限是3.6nmol／L（S／N＝3）。同一支 NO微傳感器連續5次相同檢測，相對標準差（RSD）為2.4%，將同批制備的5支NO微傳感器在相同條件下檢測，RSD為4.6%，表明該傳感器具有良好的重現性。將傳感器在室溫下放置7d，其響應電流是放置前的95%，提示其穩定性優異。干擾試驗的結果顯示：2 μmol／L的 NO2-、多巴胺（DA）、抗壞血酸（AA）和 NH4＋，或20μmol／L的NO3-、尿酸（UA）、葡萄糖等物質對NO的檢測不產生干擾（信號變化小于5%）。因此，該傳感器具有良好的選擇性，可用于檢測生物樣品中NO含量。

3 討 論

硝酸甘油作為治療突發性心絞痛的特效藥已沿用了100多年，其藥理作用是硝酸甘油在生理條件下釋放出的NO可以舒張心血管平滑肌，近年逐漸發現NO在生物體內發揮著更多重要的作用。NO作為一種重要的生物信使分子，參與血管調節、神經傳遞、炎癥與免疫等過程，其廣泛分布在腦、血管、肺、生殖器等多種組織器官中，且與高血壓、心肌缺血、動脈硬化和哮喘等系統性疾病有關［6-8］。對NO的認識首先要歸功于微量分析技術的發展，因為NO在機體內的濃度通常處于納摩爾級水平，且NO半衰期為5s，因而直接檢測難度極大［9］。因此，準確地分析NO在生物機體中的濃度變化，已成為進一步揭示NO功能的必要手段。

建立準確、簡便、快速、靈敏的NO檢測方法成為醫學界普遍關心的問題，重氮反應法是目前應用最為廣泛的方法之一，其原理是通過檢測NO的代謝終產物NO2-和NO3-來間接推算出NO的濃度。但機體中NO2-和NO3-不完全來源于NO代謝，這就造成該方法存在較大誤差［10］。電化學方法能夠直接、實時、連續檢測生物體內釋放的NO，其特點是靈敏度高、響應快、操作簡單、選擇性好、儀器設備成本低［11］。安培響應法是在工作電極和參比電極間施加一個固定電位，通過檢測NO氧化時所產生的微小的氧化峰電流，氧化峰電流與NO的濃度呈成正相關。其具有靈敏度高和響應時間快等優點，可用于檢測生物體內NO濃度隨時間變化的情況［12］。

納米金具有良好的生物兼容性和優異的電催化性能［13］，本研究選擇直徑為150μm的柱狀玻璃纖維為基底材料，采用原位化學種子-生長技術，制備了一種基于納米金柱的NO電化學微傳感器。采用快速化學還原法制備納米金晶核，并將晶核作為種子吸附在玻璃纖維表面；然后在穩定的生長溶液中將氯金酸還原為金單質，隨著金單質在納米金晶核上不斷析出，納米金顆粒逐漸變大，從而實現納米金顆粒的可控生長。Teflon是目前已知所有聚合物中透氣性最高的高分子化合物［14］，允許NO以與樣品中的NO濃度成比例的速度通過Teflon膜達到電極表面并被氧化，大大加快了傳感器的響應時間。Teflon膜還可以防止蛋白質等一些生物分子在電極表面的非特異性吸附而引起的電極表面鈍化，從而提高電極的穩定性和電極的使用壽命。本研究還考察了體內存在的一些電活性強的物質對微傳感器檢測的影響，發現微傳感器不受高濃度的亞硝酸鹽、硝酸鹽、多巴胺、抗壞血酸、銨鹽和L-精氨酸等生物小分子的干擾，信號變化均小于5%，且干擾實驗前后加入同濃度的NO標準溶液，其安培響應無顯著差別。因此，本方法制備的微傳感器表現出靈敏度高、線性范圍寬、重現性好和抗干擾能力強等優點。

綜上所述，NO電化學微傳感器的使用為NO的實時檢測和生物樣品的檢測提供了一種實用、簡便的方法，不僅能夠從本質上揭示某些生理現象，也為探索相關疾病的監控和病理研究提供了技術保障。

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