橘紅色花菜薹突變體的發現和研究

（北京市農林科學院蔬菜研究中心，北京 100097）

菜薹〔Brassica campestrisL.ssp.chinensis（L.）Makino var.utilisTsen et Lee〕別名菜心、綠菜薹、菜尖，起源于我國南部，在廣東、廣西栽培歷史悠久，是易抽薹白菜經長期選擇和栽培馴化的產物，并演化為不同的類型和品種。菜薹質地柔軟，風味可口，營養豐富，不僅在南方地區普遍種植，近年來北方地區也有栽培。

突變體在植物品種改良上具有重要的應用價值。一方面，通過基因突變產生的突變體，可以創造出新的種質資源，增加物種的遺傳多樣性；另一方面，突變體作為標記性狀，可以輔助辨別親本和一代雜種，顯著提高商品種子的純度和質量。同時，突變體在基因定位、克隆和基因表達、調控等分子生物學研究領域也具有重要意義。

菜薹的花色以黃色為主，但也存在其他花色。2011年5月，筆者在1份菜薹育種材料F3群體中發現了1株突變體，其花色為橘紅色。眾所周知，橘紅心大白菜的花色為橘紅色，是一種特殊的大白菜類型，其資源來源于日本。研究發現，大白菜橘紅心球色為質量性狀，控制橘紅心球色的基因為隱性單基因or（張德雙 等，2003）。橘紅心大白菜具有較高的營養價值，VC含量306.0 mg·kg-1，β-胡蘿卜素含量2.6 mg·kg-1（FW），居所有類型大白菜品種之首，尤其是β-胡蘿卜素含量，更是普通大白菜品種的6倍以上（張德雙 等，2004）。

劉秀村等（2003）應用大白菜DH 群體，獲得了1個與橘紅心大白菜球色基因緊密連鎖的RAPD 分子標記OPB01845，遺傳距離為3.8 cM，并將其轉化為SCAR 標記SCB01-845。隨后，又發現了1個與橘紅心球色基因連鎖的SCAR 標記（王國臣 等，2007；Zhang et al.，2008），并最終將or基因定位在大白菜1號染色體的長臂末端（于拴倉 等，2007）。Feng 等（2010）獲得了與橘紅心基因連鎖的3個SSR 標記，其中sau（C）586、syau19 在or基因同側，遺傳距離分別為1.6 cM 和1.3 cM；syau15位于另一側，遺傳距離為3.3 cM。

本試驗的目的是研究菜薹橘紅色花的遺傳規律，并應用與大白菜橘紅心球色基因連鎖的SSR分子標記對控制菜薹橘紅色花的基因進行分析，鑒定菜薹的橘紅色花基因與大白菜的橘紅心球色基因or是否相同，為今后選育橘紅色花菜薹一代雜種和獲得新的橘紅心大白菜種質資源奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

橘紅色花菜薹11A-47 是筆者于2011年5月發現的1株突變體，其葉色為翠綠色，葉形為近橢圓 形，莖翠綠色，分枝較旺，花色為橘紅色，鮮艷且較深（圖1）。黃色花菜薹品種為聯記特選34號甜菜心，該材料已自交7代，遺傳性狀穩定、純合，葉色深綠，葉形為圓形，莖綠色，分枝較旺，花色為黃色。供試材料均來源于北京市農林科學院蔬菜研究中心白菜課題組。

圖1 橘紅色花菜薹突變體11A-47

1.2 方法

1.2.1 子葉顏色調查方法 2011年5月，在本中心對橘紅色花菜薹11A-47 進行自交留種；同時以11A-47 為父本，與黃色花菜薹進行雜交，獲得F1種子。2012年6月初，F1自交獲得F2，再以F1為母本分別與黃色花菜薹、11A-47 雜交，分別獲得BC1和BC1′。參考耿新翠等（2012）的方法并加以改進，調查子葉顏色：7月初，將P1、P2、F1、F2、BC1和BC1′6個世代的種子放置在4℃冰箱中，低溫遮光處理15 d后取出，用肉眼觀測子葉顏色，記錄并對數據進行方差分析。然后，將6個世代種子分別播種到50 孔穴盤中，直到開花，調查并記錄各單株花瓣顏色。

1.2.2 根部和髓部顏色調查方法 2012年7月初，待11A-47 和黃色花菜薹的自交種子收獲結束后，拔取11A-47 與黃色花菜薹各20株，將菜薹根部洗凈，比較11A-47 與黃色花菜薹的根部顏色。再將根部橫切即獲得髓部，比較二者髓部顏色。

1.2.3 花蕾和花瓣顏色調查方法 在菜薹盛花期，比較11A-47 與黃色花菜薹的花蕾及花瓣顏色。

1.2.4 分子標記方法 以來源于大白菜R9 連鎖群（即大白菜1號染色體）、并與橘紅心球色基因or連鎖的11對SSR 引物對黃色花大白菜、橘紅色花大白菜、黃色花菜薹和11A-47 進行標記分析。引物分別為Feng 等（2010）的5 對SSR 引物sau（N）033、sau（C）586、syau15、syau19、ENA21，本中心耐寒類蔬菜育種研究室設計的5 對SSR 引物ba14066、PD7413、PD1355、PD6142、PD7418 和Wang 等（2011）的1對SSR 引物BRID90153。

反應體系（12.5 μL）：1μL 50 ng 模板 DNA，0.6 μL dNTP（2.5 mmol·mL-1），1.25 μL 10×buffer（含Mg2+），上下游引物各0.8 μL（0.5 μmol·mL-1），0.15 μLTaq酶，7.9 μL ddH2O。PCR 反應程序：95℃ 3 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 45 s，共35個循環；72℃延伸10 min。擴增產物用3%超高分辨率瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 橘紅色花菜薹突變體11A-47 的植物學性狀

2.1.1 橘紅色花菜薹子葉顏色的遺傳規律 橘紅色花菜薹突變體11A-47 6個世代各單株子葉顏色和卡方檢測結果見表1和圖2。親本P1為普通黃色花菜薹，子葉顏色全部為綠色；親本P2為橘紅色花菜薹，子葉顏色全部為桔紅色，二者雜交F1的子葉顏色均為綠色，說明橘紅色花對黃色花為隱性；F2世代子葉顏色出現了分離，橘紅色與綠色單株的分離比例符合1∶3，χ2=1.938 9 ＜χ20.05=3.841；BC1世 代中橘紅色單株數量很少，約占4.36%；BC1′世代中橘紅色與綠色單株的分離比例符合1∶1，χ2=1.369 7 ＜χ20.05=3.841。

2.1.2 橘紅色花菜薹根部和髓部顏色 11A-47 與黃色花菜薹根部、髓部顏色見圖3和圖4。11A-47 的根部、髓部顏色均表現為橘紅色，而黃色花菜薹的根部、髓部顏色均表現為白色。據報道，絕大多數類胡蘿卜素呈黃色、橘紅色或紅色，是許多花、果實和胡蘿卜根呈現各種顏色的原因（Bartley & Scolnik，1995）。橘紅心大白菜葉球之所以呈現橘紅色，就是由于高含量β-胡蘿卜素等類胡蘿卜素的積累所致（Bartley & Scolnik，1995；張華敏 等，2009）。本試驗中，橘紅色花菜薹11A-47 的根部、髓部顏色均為橘紅色，充分表明這些器官積累了類胡蘿卜素。

2.1.3 橘紅色花菜薹花蕾和花瓣顏色 11A-47 與黃色花菜薹花蕾、花瓣顏色見圖5 和圖6。11A-47 的花蕾顏色為淺綠色，花瓣為桔紅色，花色鮮艷且較深。而黃色花菜薹花蕾顏色為綠色，花瓣為黃色。

表1 黃色花菜薹×11A-47 各世代子葉顏色和卡方檢測結果

2.2 SSR分子標記擴增結果

11對SSR 引物對黃色花大白菜、橘紅色花大白菜、黃色花菜薹和11A-47 的擴增結果見圖7 和表2。其中，BRID90153、PD1355、sau（N）033、sau（C）586、syau15、syau19 等6 對引物可在11A-47 與橘紅色花大白菜基因型中擴增出差異產物，而其余5 對引物則沒有擴增出差異產物。由此可見，控制菜薹11A-47 橘紅色花的基因與控制大白菜橘紅心球色的基因可能不同。

圖2 黃色花菜薹×11A-47 6個世代各單株子葉顏色

圖3 11A-47 與黃色花菜薹的根部顏色

圖4 11A-47 與黃色花菜薹的髓部顏色

圖5 11A-47 與黃色花菜薹的花蕾顏色

圖6 11A-47 與黃色花菜薹的花瓣顏色

圖7 SSR 引物擴增結果

表2 11對SSR 引物的擴增結果

3 結論與討論

突變體的創建方法主要有自發突變、物理誘變、化學誘變，T-DNA、轉座子、反轉座子插入等，其中自發突變是自然界普遍存在的變異。在育種實踐中，一旦發現了具有某種有利性狀的突變體，通過研究其遺傳規律并加以應用，最終可選育出具有該性狀的優良品種。

3.1 11A-47 突變體的來源

菜薹花色發生自然變異的可能性比較大。筆者發現的橘紅色花菜薹突變體11A-47 來源于1份自交2 代的F3菜薹群體。11A-47 突變體除了花色為橘紅色外，其余性狀與黃色花菜薹相似，其葉色翠綠色，葉形近橢圓形，葉柄長，莖翠綠色，腋芽萌發能力較強；且不具有菜薹與大白菜雜交后代產生的中間性狀，如葉翼等。因此，可以肯定地說，菜薹突變體11A-47 的橘紅色花基因不是來源于橘紅心大白菜，而是菜薹自然突變的產物。在調查菜薹育種材料性狀時，除了花色為橘紅色的突變體11A-47 外，筆者還發現了以白色為主且嵌有黃色的花色突變體，并可以穩定遺傳。

3.2 BC1 群體中橘紅色子葉單株存在的原因

本試驗是以子葉顏色來確定橘紅色花或黃色花單株的。BC1群體中存在極少數橘紅色子葉單株的可能原因主要有：① 在調查子葉顏色時，將個別原本為綠色子葉的單株誤定為橘紅色子葉；② 因F1花粉去雄不徹底而自交，產生少部分F2種子，混在BC1回交群體中。為了重復本試驗，筆者還播種了另外2份BC1回交群體，仍然發現具有橘紅色子葉的個別單株，橘紅色子葉與綠色子葉的比例分別是6∶85 和2∶101。同時，本試驗還發現，在盛花期，BC1回交群體依然存在橘紅色花的植株，因此，今后的重點是嚴格拔除F1雄蕊，重新獲得BC1群體，并進一步驗證上述試驗結果。

3.3 菜薹橘紅色花基因與大白菜橘紅心球色or基因的異同

控制菜薹橘紅色花的基因與大白菜橘紅心球色or基因的遺傳規律一致，即菜薹橘紅色花、大白菜橘紅心球色均為質量性狀，由1對隱性等位基因控制。本試驗應用11對與大白菜橘紅心球色基因連鎖的SSR分子標記對11A-47 進行分析，其中6 對引物擴增的產物能夠準確區分11A-47、橘紅心球色大白菜，但這6 對引物也可在黃色花大白菜或黃色花菜薹中擴增出相同的產物，即無法將黃色花大白菜、橘紅色花大白菜、黃色花菜薹和11A-47 同時區分開。由目前的研究結果初步分析可見，控制菜薹11A-47 橘紅色花的基因與控制大白菜橘紅心球色的基因可能不同。下一步，將對控制11A-47 橘紅色花的or基因進行染色體初步定位，進一步證明二者間的關系。

本試驗還發現，PD7413、PD7418、sau（N） 033、syau15、syau19 和ENA21 等6 對引物雖然已被成功用于區分黃色花和橘紅色花大白菜基因型，但在本試驗中并沒有在橘紅色花大白菜基因型中擴增出差異產物，可能是由于試驗采用的電泳檢測方法（丙烯酰胺凝膠和超高分辨率瓊脂糖凝膠）不同或這些引物與大白菜橘紅心球色or基因連鎖的不緊密等原因造成的。

3.4 菜薹橘紅色花基因的應用

筆者已經開始利用11A-47 和白心大白菜進行雜交，希望獲得表現更優的大白菜橘紅心育種資源，并進一步育成橘紅心新品種。另外，菜薹的橘紅色花基因可以使其根部和髓部變為橘紅色，因此采用生物技術方法有可能將該基因轉到蘿卜等食用根部器官的蔬菜中，創造出更多具有橘紅色性狀的蔬菜新資源。

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