甘薯β-胡蘿卜素含量相關AFLP 分子標記的開發

靳 容， 后 猛， 馬代夫， 謝世清， 李 強

(1.江蘇徐州甘薯研究中心，中國農業科學院甘薯研究所，農業部甘薯生物學與遺傳育種重點實驗室，江蘇 徐州221131;2.云南農業大學，云南 昆明650201)

甘薯［Ipomoea batatas (L.)Lam.］是繼水稻、小麥、玉米之后的中國第四大糧食作物［1］。它富含人體必需的多種營養物質，保健價值很高，尤其是紅肉甘薯中含有大量的β-胡蘿卜素。作為維生素A 的重要合成前體，β-胡蘿卜素對預防夜盲癥有良好的效果，可有效改善婦女及兒童因夜盲癥導致的失明狀況［2-3］，具有十分重要的市場開發價值［4-5］。β-胡蘿卜素由多個基因共同控制合成［6］，并且與許多優良性狀存在負相關［7-8］，傳統育種方法周期長，直接影響到富含胡蘿卜素、綜合性狀優良品種的選育效率。

1993 年Hall 等［9］提出利用分子標記技術輔助育種，可有效提高育種效率。Ukoskit 等［10］較早地將這種方法引入甘薯育種，利用集群分離分析法(Bulked segregant analysis，BSA)［11］進行甘薯抗根腐病基因的標記分析。隨著分子標記輔助育種方法在甘薯中的應用，近年來研究人員開發了一些與甘薯重要性狀連鎖的分子標記，尤以與抗病基因連鎖的分子標記居多［12-14］。因為甘薯本身存在復雜的自交不親和性，以及染色體組的高度雜合性，難以獲得純系［15］，所以甘薯上一般利用BSA 法構建高密度遺傳連鎖圖譜。但是由于受到其他基因的干擾，利用BSA 法獲得的連鎖標記的準確度受到影響［16］，從而影響了甘薯遺傳圖譜的構建及QTL 分析。

在缺少甘薯高飽和度遺傳圖譜的情況下，Mcharo 等［17］早在2004 年就利用AFLP 標記建立模型，研究甘薯的干物率等性狀。隨后，Mcharo 等［18］和Douglas 等［19］分別利用與抗甘薯根結線蟲病(Southern root-knot nematode)和病毒病害(Sweet potato virus disease，SPVD)性狀連鎖的分子標記建立Logistic 回歸模型，定性選育抗病甘薯品種。本試驗通過篩選與甘薯高β-胡蘿卜素含量性狀相關的AFLP 分子標記，試圖建立穩定的Logistic 回歸模型，在無需測定甘薯塊根β-胡蘿卜素含量的情況下，特別是在甘薯早代育種過程中，可以快速、準確地篩選出高β-胡蘿卜素含量的甘薯材料，為高β-胡蘿卜素甘薯品種(系)的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

建池與引物篩選材料:徐薯25(白肉、低胡蘿卜素含量甘薯品種)、徐薯22-5(紅肉、高胡蘿卜素含量甘薯品系)，及其雜交F1代分離材料共14 份。

模型驗證材料:除建池雙親(徐薯25 和徐薯22-5)外，另外選擇4 個高β-胡蘿卜素桔紅肉甘薯品種(系)浙薯81、徐083228、徐070339、徐052701 和4 個低β-胡蘿卜素白肉甘薯品種(系)徐薯22、徐薯26、徐薯28、徐053601 共計10 個品種(系)作為Logistic 回歸模型驗證材料。

1.2 樣品處理和基因組DNA 提取

在大田甘薯苗期，取所有試驗用甘薯材料的頂部新鮮嫩葉3 ～5 片，在液氮中充分冷凍研磨成粉末，裝入1.5 ml 的離心管中，－80 ℃保存。按照李強等［20］方法提取基因組DNA，Nanodrop1000 微量紫外分光光度計檢測提取的DNA 濃度，終濃度用1 ×TE 溶液稀釋到50 ng/μl。0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA。

1.3 AFLP 分析

參照李強等［21］的AFLP 擴增方法，首先用EcoR I 和Mse I 消化樣品DNA，然后用T4 連接酶16 ℃連接酶切產物12 h。將酶切連接產物用帶有1 個選擇性堿基的引物組合進行預擴增，得到的PCR 產物再用帶有3 個選擇性堿基的引物對其進行AFLP 分析，PCR 反應體積20.0 μl，其組分為TaqE buffer(+KCl)，1.25 U Taq DNA 聚合酶(TaqE)，0.2 mmol/L dNTP mix，1 μmol/L引物，3.5 μl 稀釋后的預擴增產物進行PCR 反應。本試驗所用內切酶、連接酶、TaqE 及dNTP 均購自Fermentas 公司。雙酶切反應、連接反應、預擴增反應和選擇擴增反應均在Cycler PCR 儀(BIO-RAD)上進行。反應所用接頭、預擴增以及選擇擴增引物均由上海生工生物工程技術有限公司合成。

1.4 β-胡蘿卜素含量的測定

采用丙酮提取比色法［22］測定甘薯樣品中β-胡蘿卜素的含量(略有改動)。取健壯薯塊，沖洗晾曬或吸水紙擦干后，去皮縱切，四分法取樣。稱取薯塊樣品1.0 g，加入少量丙酮研磨，至提取液無色，定容至25.0 ml，3 000 r/min離心5 min，取上清液測定454 nm 波長處光密度。同一甘薯樣品取樣3 次，取平均值。β-胡蘿卜含量按以下公式計算:

式中，CA:β-胡蘿卜素含量(單位為mg/g);A:丙酮液的消光度。

1.5 Logistic 回歸分析

分別根據EcoR I 和Mse I 酶切和接頭序列，各設計引物序列20 條，共計400 對引物組合，利用建池材料從400 對引物中篩選出5 對與高β-胡蘿卜素含量性狀相關的引物組合(表1)。利用篩選出的引物組合，對甘薯材料進行AFLP 分析，使用SPSS Statistics 17.0 軟件構建Logistic 回歸模型［23］，并檢測該模型中的每個材料是否符合預期結果。

表1 AFLP 分子標記引物組合序列Table 1 Primer sequences of AFLP markers

構建Logistic 回歸模型的過程中，首先對篩選出的AFLP 標記進行多態性賦值，出現條帶的記為1，沒有出現條帶的記為0，經過列聯表整理后，用作構建Logistic 回歸模型的自變量。篩選自變量采用向前法，即按照篩選出的標記對β-胡蘿卜素合成基因的貢獻(P 值的大小)由小到大依次挑選，所有P 值均小于臨界值0.05，檢測該模型中分子標記預測的每個材料是否符合胡蘿卜素含量高低劃分的結果。并用模型系數的混合檢驗(Omnibus tests of model coefficients)、對數似然比檢驗(Log-Likelihood ratio test)以及Hosmer-Lemeshow 檢驗(Hosmer and Lemeshow test)分析評價該模型。

Logistic 回歸模型:表型(即胡蘿卜素含量高低)分組概率公式為:

其中P 為表型分組概率;β0為截距;β1、β2…βp為偏回歸系數。

2 結果

2.1 β-胡蘿卜素含量

根據2008 和2009 年連續2 年對F1代分離群體β-胡蘿卜素含量的測定結果，選擇雜交后代中β-胡蘿卜素含量位于2 個極端的樣品，共計41 系(表2)。按照β-胡蘿卜素含量的不同，對選出的材料進行分組，分為高β-胡蘿卜素含量組和低β-胡蘿卜素含量組，從表2中可以看出，高β-胡蘿卜素含量組共有19 個樣品，甘薯中β-胡蘿卜素含量的變化范圍為0.096 1 ～0.185 6 mg/g，肉色全部為橘紅色;低β-胡蘿卜素含量共有22個樣品，由于該組β-胡蘿卜素含量極低，多數樣品利用丙酮提取法無法測到，最高值也僅為0.003 3 mg/g，肉色為淡黃至白色。甘薯β-胡蘿卜素含量的高低與肉色有很大聯系，通常情況下，β-胡蘿卜素含量高的甘薯品種肉色為深黃色至橘紅色，含量低的肉色為白色至淡黃色［24］，白肉甘薯品種中的β-胡蘿卜素含量通常趨近于0［25-26］，這些都與本試驗結果相一致。

2.2 Logistic 回歸結果

在理想的Logistic 模型中，所有高β-胡蘿卜素組的概率值應趨向于0，所有低β-胡蘿卜素組的概率值應趨向于1。本試驗結果(表2)顯示，高β-胡蘿卜素組中z118 概率值≥0.50，z162 和z058 概率值分別為0.30 和0.20，其余樣品分組概率值均≤0.10，19 個樣品中有13 個樣品分組概率為0，樣品的平均分組概率P 為0.068;低β-胡蘿卜素組中z008 概率值為0，z105 概率值為0.60，其余樣品分組概率都≥0.90，22 個樣品中14 個樣品分組概率為1.00，樣品的平均分組概率P 為0.868。把分組概率P ＜0.50 的樣品歸為高β-胡蘿卜素組，分組概率P ＞0.50 的樣品歸為低β-胡蘿卜素組。依據此標準，高β-胡蘿卜素組的z118 和低β-胡蘿卜素組中的z008 不符合分組，其余39 個樣品符合分組，正確度高達95.1%。

為了驗證該模型擬合度，本試驗對其進行了模型系數的混合檢驗、對數似然比檢驗以及Hosmer-Lemeshow 檢驗。模型系數的混合檢驗是針對步驟、模塊和模型開展模型系數的綜合性檢驗。結果顯示，不論是步驟、模塊和模型的卡方值均大于顯著性水平0.05 的卡方臨界值，因此該Logistic 回歸模型通過檢驗。

對數似然比檢驗中，－2lgL 越小，說明自變量的作用越顯著，模型擬合效果越好。該Logistic 回歸分析中每一步的－2lgL 值都在不斷減小，隨著模型的逐步完善，－2lgL 從最初的39.444 減少到15.339，說明該模型的擬合效果不斷提高。作為補充和參照，本試驗還對該模型進行了Hosmer-Lemeshow 檢驗，結果顯示，高胡蘿卜素組的期望值(Expected)逐漸減少到0，與觀測值(Observed)趨于接近;低胡蘿卜素組的期望值逐漸增加到4，與觀測值也趨于接近。綜上所述，本試驗構建模型的整體擬合效果較好。

表2 F1 代分離群體表型分類Table 2 Phenotypic classification of F1 half-sibs based on β-carotene content of sweetpotato

2.3 Logistic 回歸模型可行性分析

為了進一步分析Logistic 回歸模型在甘薯育種中可行性，根據胡蘿卜素含量結果，把驗證用的10種胡蘿卜素品種(系)分成高胡蘿卜素品種(系)和低胡蘿卜素品種(系)進行Logistic 回歸分析，供試樣品通過Logistic 回歸分析，所得分組概率如表3 所示。高β-胡蘿卜素組5 個樣品分組概率值均≤0.10，低β-胡蘿卜素組5 個樣品分組概率都≥0.90。供試材料分組概率全部符合預先表型分析，結果表明該Logistic 回歸模型可以用于高β-胡蘿卜素甘薯品種的分子標記輔助選育。

表3 驗證甘薯樣品表型分類Table 3 The verification of phenotypic classification for β-carotene content in sweetpotato samples

3 討論

目前，通過多個分子標記建立統計模型來研究甘薯數量性狀的方法只有Discrimination 分析與Logistic 回歸分析，Logistic 回歸分析比Discrimination分析更加精準，用到的分子標記數目更少，應用也更方便［27］。利用分子標記輔助育種的方法有QTL 分析，但QTL 分析需要預先已知甘薯的遺傳圖譜［28-30］;其次，β-胡蘿卜素合成基因相關QTL 也有可能分布在甘薯白肉品種中［31］，因而這些QTL 不能直接應用到甘薯高β-胡蘿卜素育種中;再者，構建遺傳圖譜和QTL 分析要求建譜親本純度高［32］，且QTL 分析只適用于親本的分離群體，而使用多個分子標記構建的Logistic 統計模型則對樣品材料無特殊要求。

本研究利用5 個與高β-胡蘿卜素含量性狀相關的AFLP 分子標記建立Logistic 回歸方程，檢驗徐薯22-5 與徐薯25 的41 個甘薯雜交后代的β-胡蘿卜素含量高低是否符合預期的β-胡蘿卜素分組，僅2 個樣品不符合預期分組，正確率高達95.1%，能夠準確預測大多數甘薯樣品中β-胡蘿卜素含量高低。如果將更多與β-胡蘿卜素合成相關的分子標記引入該模型，其正確率完全能夠達到100%，使模型達到最優水平。該模型不僅完全通過模型系數的混合檢驗、對數似然比檢驗以及Hosmer-Lemeshow 檢驗，具有較高的擬合度，而且用于構建模型的AFLP 分子標記較之RAPD 和SSR 等分子標記，其多態性高、穩定性好［33］。10 個高(低)胡蘿卜素品種(系)全部通過該Logistic 回歸模型分析，充分證明了該模型的可靠性。

Delia 等［34］曾指出使用高效液相色譜(HPLC)分析紅肉甘薯品種中的類胡蘿卜素含量，其中β-胡蘿卜素含量最高，其他類胡蘿卜素組分含量極低，甚至可以忽略不計。因此，本研究測定甘薯β-胡蘿卜素含量的方法，不但簡單易行，而且準確度較高。試驗中所挑選的甘薯樣品依據胡蘿卜素含量的高低呈雙峰分布，這樣不但易于分組，而且使得篩選出的同一個分子標記在2 組樣品之間出現的條帶數目差異性大，優化Logistic 模型。

由于不同生長發育期，甘薯塊根所含β-胡蘿卜素含量也有一定的差異，一般表現為生長后期β-胡蘿卜素含量高于中、前期［35-36］，所以傳統育種只有等到甘薯塊根成熟后，切開薯塊，然后通過肉眼觀察甘薯肉色或是測量β-胡蘿卜素含量，才能得知該材料是否屬于高β-胡蘿卜素甘薯品種。但是，這種傳統育種方法不但破壞甘薯薯塊，而且育種周期長、育種速度緩慢。本試驗在注重改善其他農藝性狀的同時，結合分子標記輔助育種，在甘薯早代育種過程，特別是在實生苗篩選中，通過田間早期地上部表現結合分子標記手段，在不影響甘薯塊根正常生長的情況，提前淘汰不符合育種目標的個體，既減輕工作負擔，又提高育種的準確性，從而縮短育種年限。

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