P2RX7和組蛋白修飾變化在曲古抑菌素A緩解煙草煙霧暴露所致小鼠卵巢損傷中的作用

苗佳寧，叢艷飛，李芳，婁毅，王莉莉△

煙草煙霧（cigarette smoke，CS）暴露是女性生育能力下降和卵巢早衰的重要環境危險因素［1］。研究發現，CS 對卵巢損害極大［2-3］，會導致卵巢的結構發生改變，并會影響激素合成、卵泡發育［2］、卵母細胞質量和卵母細胞的線粒體功能［4-5］。筆者前期研究發現，CS 暴露后小鼠卵巢的皮質發生萎縮，總體積減小，卵泡總數減少，尤其是原始卵泡數目顯著降低，應用組蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制劑曲古抑菌素 A（Trichostatin A，TSA）可以抑制 HDAC1 和HDAC2 表達以及 NLR 家族 Pyrin 域蛋白 3（NLRP3）炎性小體介導的細胞焦亡，改善CS暴露引起的卵巢損傷［6］。P2RX7 是重組嘌呤 P2X7 受體［7-8］，可激活NLRP3炎癥小體介導的細胞焦亡［9-10］。然而，P2RX7是否參與CS 暴露激活卵巢組織中NLRP3 炎性小體介導的細胞焦亡以及TSA 緩解卵巢損傷的過程，目前尚不清楚。組蛋白修飾水平變化與許多環境毒素導致的卵巢毒性損傷作用有關［11-12］。筆者前期研究發現，組蛋白修飾變化參與CS暴露對子宮的毒理作用和TSA 的緩解過程［13］。然而，組蛋白修飾變化是否參與了CS 暴露對卵巢的毒理作用和TSA 的緩解過程，尚不清楚。本研究旨在探索P2RX7和組蛋白修飾變化在TSA 緩解CS 暴露所致小鼠卵巢損傷過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 60 日齡SPF 級C57 BL/6 雌性小鼠36 只，體質量（20.0±0.5）g，購自遼寧長生生物技術有限公司［SCXK（遼）2015-0001］。實驗動物飼養于中國醫科大學附屬盛京醫院實驗中心SPF 級動物飼養室［SYXK（遼）2017-0004］。所有針對實驗動物的操作符合動物倫理，并通過中國醫科大學附屬盛京醫院醫學倫理委員會批準（2019PS263K）。

1.1.2 試劑與儀器 雄獅牌香煙（每支含0.7 mg 尼古丁和8 mg焦油）購于浙江中煙工業有限公司；蘇木素、伊紅購于北京索萊寶公司；組蛋白提取試劑盒購于美國EPIGENTEK 公司；RIPA 裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）及十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）凝膠配制試劑盒購于上海碧云天公司；BCA蛋白檢測試劑盒及ECL化學發光顯色試劑盒購于美國Thermo Fisher公司；TSA購于美國Sigma公司。一抗來源：鼠源GAPDH 購于上海康成生物公司；兔源HDAC1、NLRP3、Zeste同源物增強子2（EZH2）和鼠源HDAC2購于美國CST 公司；兔源P2RX7 購于武漢Proteintech 公司；兔源 H3、H3K4me1、H3K4me2、H3K9ac 購于武漢 ABclonal 公司；鼠源H3K27me3 購于美國ACTIVE MOTIF 公司。羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗購于美國Abbkine 公司。其他試劑均為國產分析純。石蠟輪轉切片機購于德國Leica 公司；顯微鏡購于日本Nikon公司；酶標儀購于美國BioTek公司；Western blot垂直電泳槽購于美國Bio-Rad 公司；小型槽式轉印儀和超靈敏化學發光儀購于美國GE Amersham Biosciences公司。

1.2 研究方法

1.2.1 煙草煙霧暴露小鼠模型 將36只C57 BL/6雌性小鼠按完全隨機數字表法分為對照（control）組、CS 組和CS+TSA組，每組12只，對小鼠編號并記錄初始體質量。自制實驗性CS 暴露裝置，CS 暴露詳細方法參照本課題組前期實驗［6，14］。CS 組和 CS+TSA 組小鼠CS 暴露時間為30 d，每日2 次（間隔5 h），每次6支煙持續暴露2 h。對照組小鼠吸入空氣。在CS暴露的同時（第1天起），CS+TSA組腹腔內注射TSA（0.6 μg/g體質量），每2日1次，持續30 d。CS暴露30 d后，對小鼠實施安樂死，并收集小鼠的卵巢組織用于進一步研究。

1.2.2 HE染色 各組小鼠的卵巢組織用4%多聚甲醛固定，經梯度乙醇洗滌、脫水后二甲苯透明，浸在石蠟中進行組織包埋，5 μm厚度連續切片，進行HE染色，中性樹脂封片后置于光學顯微鏡（×40）下觀察并拍照。

1.2.3 Western blot 提取各組小鼠卵巢組織總蛋白和組蛋白，通過BCA 法進行蛋白定量，然后將提取的各組卵巢組織的蛋白進行SDS-PAGE，通過濕轉法進行轉膜，脫脂奶粉封閉。選用GAPDH 作為總蛋白內參，H3 作為組蛋白內參，評估各指標的變化，一抗4 ℃孵育過夜，一抗稀釋比為GAPDH（1∶5 000）、HDAC1（1∶500）、HDAC2（1∶500）、NLRP3（1∶500）、P2RX7（1∶500）、EZH2（1∶500）、H3（1∶1 000）、H3K4me1（1∶1 000）、H3K4me2（1∶1 000）、H3K27me3（1∶1 000）、H3K9ac（1∶1 000）。利用HRP標記的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG 二抗（1∶3 000）繼續孵育2 h 后，進行ECL 發光。實驗結束后用Image-J軟件對光密度值進行分析。

1.3 統計學方法 采用GraphPad Prism 5.0軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組卵巢組織結構改變 與control組相比，CS組小鼠卵巢的總體積減小，卵泡總數減少，卵巢皮質發生萎縮，TSA可以有效抑制CS暴露引起的小鼠卵巢的上述形態學改變，見圖1。

2.2 TSA 抑制CS 暴露誘導的小鼠卵巢組織P2RX7激活 CS 組小鼠卵巢組織中HDAC1、HDAC2、NLRP3 和P2RX7 表達水平較control 組明顯升高，CS+TSA組較CS組降低（P＜0.05），見圖2、表1。

Fig.1 HE staining was used to observe the morphology of mouse ovary(×40)圖1 HE染色觀察各組小鼠卵巢組織形態（×40）

Fig.2 Comparison of protein expression levels of HDAC1,HDAC2,NLRP3 and P2RX7 between the three groups圖2 3組HDAC1、HDAC2、NLRP3、P2RX7蛋白表達水平比較

Tab.1 Comparison of protein expression levels of HDAC1,HDAC2,NLRP3 and P2RX7 between the three groups表1 3組HDAC1、HDAC2、NLRP3、P2RX7蛋白相對表達水平比較 （n=12）

2.3 H3K27me3 和EZH2 在小鼠卵巢組織中的表達 CS 組小鼠卵巢組織H3K27me3 表達水平增加，EZH2 表達水平降低（P＜0.05）；應用TSA 后可抑制卵巢組織中EZH2表達水平，對H3K27me3表達水平無明顯影響，見圖3、表2。

Fig.3 Comparison of protein expression levels of EZH2 and H3K27me3 between the three groups圖3 3組EZH2和H3K27me3蛋白相對表達情況

Tab.2 Comparison of protein expression levels of EZH2 and H3K27me3 between the three groups表2 3組EZH2和H3K27me3蛋白相對表達水平比較

2.4 各組卵巢組織組蛋白H3K4me1、H3K4me2、H3K9ac 修飾水平變化 CS 組小鼠卵巢組織H3K4me1、H3K4me2 和 H3K9ac 表達水平較 control組明顯升高，TSA可有效抑制CS暴露誘導的小鼠卵巢組織 H3K4me1、H3K4me2 和 H3K9ac 的表達上調（P＜0.05），見圖4、表3。

Fig.4 Comparison of protein expression levels of H3K4me1,H3K4me2 and H3K9ac between the three groups圖4 3組H3K4me1、H3K4me2、H3K9ac蛋白相對表達情況

Tab.3 Comparison of protein expression levels of H3K4me1,H3K4me2 and H3K9ac between the three groups表3 3組H3K4me1、H3K4me2、H3K9ac蛋白相對表達水平比較 （n=12）

3 討論

本研究發現，CS 暴露后小鼠卵巢的總體積減小，卵泡總數減少，卵巢皮質發生萎縮，TSA 可以有效抑制CS暴露引起的小鼠卵巢的上述形態學改變。CS 暴露后小鼠卵巢組織中HDAC1、HDAC2 和NLRP3表達水平明顯升高，而TSA有效抑制了CS暴露誘導的小鼠卵巢組織上述蛋白的表達。以上結果和筆者之前的研究［6］結果一致。目前NLRP3炎性體是研究最為廣泛的炎性體之一，在焦亡中可發揮關鍵作用［15］。細胞焦亡與小鼠卵巢組織的冷凍保存和自體移植過程中的卵泡丟失有關，而抑制細胞焦亡可以改善移植卵巢的功能［16］。P2RX7 可以激活NLRP3炎癥小體介導的細胞焦亡［8］。小鼠和豬的卵巢中表達P2RX7，但有關其在卵巢組織中作用的研究甚少。有研究報道P2RX7 激活和卵泡膜細胞的凋亡有關［9］。此外，卵巢組織中P2rx7的表達變化引起的細胞周期和增殖異常與CRYBB2基因敲除所致卵巢形態和功能異常有關［10］。P2RX7在維持卵巢發育和功能中發揮著重要作用。本研究發現，CS暴露后小鼠卵巢組織P2RX7 表達水平明顯升高，而TSA有效抑制了CS暴露激活的P2RX7表達上調。因此，P2RX7 參與CS 暴露激活卵巢組織中NLRP3 炎性小體介導的細胞焦亡以及TSA 緩解卵巢損傷的過程，可能作為治療CS 暴露導致的女性生育能力受損的新的靶點。

組蛋白修飾水平變化與許多環境毒素導致的卵巢毒性損傷作用有關。亞硝酸鈉（NaNO2）處理可降低卵母細胞數量，此外，NaNO2能破壞MⅡ紡錘體完整性，導致線粒體分布異常，腺苷三磷酸（ATP）含量降低，活性氧（ROS）和H3K4me2 水平升高［11］。高劑量的喹乙醇可損害卵母細胞成熟和早期胚胎發育，并且可導致卵巢組織中H3K4me2 和H3K9me3 修飾水平異常［12］。產前尼古丁暴露（PNE）可誘導后代卵巢發育不良，PNE 可誘導雌性大鼠后代卵巢發育不良并抑制雌二醇合成，這與P450 啟動子區H3K9ac和H3K27ac 修飾水平降低有關［17］。但是，在卵巢組織中CS 暴露能否通過改變組蛋白修飾參與其對卵巢的毒理作用和TSA的緩解過程，目前尚不清楚。

本研究發現，CS 暴露后小鼠卵巢組織H3K27me3表達水平增加，TSA對H3K27me3表達水平無明顯影響；CS 暴露后小鼠卵巢組織中EZH2 表達水平降低，應用TSA 后進一步抑制卵巢組織中EZH2 表達水平表明H3K27me3 和其組蛋白甲基轉移酶EZH2表達水平的變化在煙草煙霧對小鼠卵巢的損傷中發揮了作用。但是，其在TSA 緩解的煙草煙霧暴露所致的小鼠卵巢損傷過程中作用并不明顯。此外，CS暴露后還可以導致小鼠卵巢組織染色質構象激活的修飾，本研究結果表明，H3K4me1、H3K4me2 和H3K9ac 修飾水平變化參與煙草煙霧對小鼠卵巢的損傷過程，且在TSA 緩解的煙草煙霧暴露所致的小鼠卵巢損傷過程中發揮重要作用，而CS暴露能夠通過激活小鼠卵巢組織中HDAC1、HDAC2和P2RX7 激活的NLRP3 介導的細胞焦亡導致卵巢結構損傷，TSA 可以抑制上述蛋白的活化，緩解CS暴露引起的卵巢組織形態改變。CS 暴露和TSA 處理后卵巢組織中 HDAC1、HDAC2、NLRP3 和 P2RX7表達水平的變化是否和激活型H3K4me1、H3K4me2、H3K9ac 及 H3K9me1 組蛋白修飾水平變化有關，這些激活型的組蛋白修飾具體結合到哪些染色質位置，有待后續深入研究。

綜上所述，P2RX7 和組蛋白修飾變化參與TSA緩解煙草煙霧暴露所致的小鼠卵巢損傷的過程。本研究為闡明煙草煙霧暴露導致女性卵巢受損的分子機制提供了新的思路，為今后治療吸煙引起的女性卵巢損傷和不孕提供了新的靶點。