銀翹散精簡方、玉屏風散提取物在雞胚中抗甲型流感病毒FM1株阻斷與抑制作用研究

胡楠楠， 王雪峰， 王子， 岳志軍， 南春紅， 朱萬青， 暴春曉

流感病毒（influenza virus）屬于正黏病毒科成員，為單分子負鏈RNA病毒，能引起上下呼吸道疾病，中藥在抗病毒方面有其獨特的優勢，特別是不易造成耐藥性的優點，而在抗病毒研究和應用中備受關注。

自清初“溫病學說”興起，中醫藥對類流感樣溫病初期的治療更上一個新的臺階，吳鞠通提出“治上焦如羽，非輕不舉”創“銀翹散”方沿用至今。在當今抗生素耐受、病毒變異等的現狀下，中醫藥對于外感熱病，在“扶正祛邪”總原則指導下彰顯新的特點：一是在治療用藥上，從抗病原微生物作用的深入探討“祛邪”治則，提出傳統“肺毒熱”理論［1］，循先證而治以“截斷扭轉”并且“清熱解毒”貫穿始終；二是重視“扶正”，外邪入侵“首犯肺衛”，并且重視地域、節氣的差別，“未病先防，已病防變”，在外感熱病中適時應用清熱解毒辛涼解表法和補肺實衛益氣固表法之“雙表法”相結合，清熱解毒辛涼解表法代表方劑為銀翹散，補肺實衛益氣固表代表方劑為玉屏風散，臨床起效頗佳［2］。

1 實驗材料

1.1 藥物

1.1.1 銀翹散精簡方提取物制備 銀翹散精簡方由金銀花、連翹、牛蒡子、荊芥穗、薄荷（9∶9∶9∶5∶6）5味藥組成，中藥材均購于遼寧中醫藥大學附屬醫院。金銀花、連翹、牛蒡子各9 g，荊芥穗5 g，薄荷6 g。采用70%乙醇為提取溶媒，8倍乙醇，經熱回流提取2次，每次120 min。出膏率為14.44%。抽醇后，干燥粉末備用。

1.1.2 玉屏風散提取物制備 玉屏風散由黃芪、白術、防風（3∶3∶1）3味中藥組成，黃芪、白術各30 g，防風10 g，中藥材均購于遼寧中醫藥大學附屬醫院。采用70%乙醇為提取溶媒，10倍乙醇，經熱回流提取2次，每次120 min。出膏率為25.16%。抽醇后，干燥粉末備用。

1.1.3 各中藥提取物供試液配制 銀翹散精簡方提取物供試液配制：38／60×12.33×小鼠體質量（g）／1 000×出膏率（14.44%）；玉屏風散提取物供試液配制：70／60×12.33×小鼠體質量（g）／1 000×出膏率（25.16%）。將各組中藥提取物用生理鹽水配制成供試液，濃度為銀翹散提取物78.3 g／L、玉屏風散提取物36.2 g／L，溶液進行藥物2倍稀釋。

1.1.4 陽性對照藥物 利巴韋林注射液（福建古田藥業有限公司，批號：0903251），生理鹽水配制成200、100 g／L溶液備用。

1.2 病毒株、雞胚 甲型流感病毒甲型流感病毒鼠肺適應株 A／FM1／47（H1N1），中國預防醫學科學研究院病毒研究所提供。在無特定病原體雞胚（9日齡，SPF級，購買于遼寧益康生物有限公司）中培養傳代恢復毒力。

1.3 主要儀器與試劑 70%乙醇、生理鹽水、利巴韋林注射液（福建古田藥業有限公司，批號：0903251），生理鹽水配制成100 g／L溶液備用等。生物安全柜（100%外排）（美國Baker公司，型號：SG403TXCE）；低溫高速離心機（德國 Heraeus，型號：BIOFUGE28RS）；臺式壓力蒸汽滅菌器（沈陽盛達生物電子設備有限公司，型號：DYMⅡ－JB20L）；AR2140電子分析天平（上海奧豪斯公司，型號：AE200）；電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠，型號：HH.B11.420）；純水機（法國 ELIX－S，型號：ZLXS5005Y）。

1.4 實驗方法

與新教思想一樣，儒家和陸九淵心學的世俗化主張并不是主張追求世俗享樂，而是主張在真實的日常世俗生活中追求成圣成賢，用更知名的話來說就是追求修身、齊家、治國、平天下。這種儒家的乃至陸九淵心學的世俗生活道德化的思想，與作為社會工作增能理論的思想基礎的新教思想是有著相同之處的。

1.4.1 甲型（H1N1）流感病毒鼠肺適應株 A／FM1／47EID50的測定 將IV原液進行對數稀釋9個濃度（10－9～10－1），接種于9日齡雞胚，每個稀釋度接種6枚雞胚，每胚接種0.1 m L，另設3個雞胚為生理鹽水對照組，每個稀釋濃度接種6個雞胚，將雞胚置于35℃恒溫箱中孵育，經10 h間隔照蛋，棄去死亡雞胚。連續觀察3 d，并作觀察記錄。

1.4.2 中藥提取物對雞胚的最大無毒濃度的測定（TD0） 將3種提取物分別用滅菌生理鹽水作連續2倍比稀釋：21、原濃度、2－1、2－2、2－3，將這5個稀釋度的稀釋液分別接種于9日齡雞胚尿囊腔，每個稀釋度接種6胚，每胚接種0.2 m L，另設3枚雞胚為空白對照組。將雞胚置于35℃恒溫箱中孵育，連續觀察雞胚生長發育情況。以雞胚可存活96 h的最大濃度作為藥物的最大無毒劑量。

1.4.3 中藥提取物在雞胚水平上對甲型流感病毒FM1株毒力阻斷作用 先將最大無毒濃度的各組中藥提取物供試液接種于9日齡雞胚，將雞胚置于35℃恒溫箱中保溫，4 h后取出，再將含有100×EID50的病毒液按每枚0.1 m L接種于雞胚。每組中藥提取物接種6枚雞胚。另設利巴韋林組（100 g／L，6枚雞胚）、病毒對照組（6枚雞胚）、正常對照組（生理鹽水）（3枚雞胚）。將雞胚置于35℃恒溫箱中孵育，經10 h間隔照蛋，棄去死亡雞胚。連續觀察3 d，并作觀察記錄。

1.4.4 中藥提取物在雞胚水平上對甲型流感病毒毒力抑制作用 先將含有100×EID50的病毒液接種于9日齡雞胚，將雞胚置于35℃恒溫箱中保溫，4 h后取出，再將最大無毒濃度的各組中藥提取物供試液接種于9日齡雞胚。每組中藥提取物接種6枚雞胚。另設利巴韋林組（100 g／L，6枚雞胚）、病毒對照組（6枚雞胚）、正常對照組（生理鹽水，3枚雞胚）。將雞胚置于35℃恒溫箱中孵育，經10 h間隔照蛋，棄去死亡雞胚。連續觀察3 d，并作觀察記錄。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行分析，Fisher精確概率檢驗法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

流感病毒雞胚半數感染量EID50為10－6。各組提取物接種尿囊液后，雜菌實驗結果均為陰性。

2.1 各組提取物對雞胚的最大無毒濃度的測定（TD0） 雞胚尿囊腔接種藥物后，每日觀察雞胚存活情況。銀翹散、玉屏風散提取物各濃度組雞胚生長發育與正常對照組基本一致；利巴韋林組雞胚發育較小。觀察72 h，銀翹散精簡方提取物自濃度39.15 g／L以下均存活，玉屏風散提取物自濃度36.2 g／L以下均存活，正常對照組與利巴韋林最高劑量組（200 g／L）、利巴韋林正常劑量組（100 g／L）雞胚均存活，但利巴韋林最高劑量組雞胚不能發育成雞雛。

銀翹散精簡方提取物自39.15 g／L，玉屏風散提取物自36.2 g／L，未見雞胚死亡，并發育良好。所以可以認為銀翹散精簡方提取物對雞胚最大無毒濃度大于39.15 g／L，玉屏風散供試液對雞胚最大無毒濃度大于為36.2 g／L，利巴韋林最大無毒劑量為100 g／L。因銀翹散（39.15 g／L）、玉屏風散提取物（36.2 g／L）原液已達到最高濃縮濃度，故在計算TI時，以該最大無毒劑量代替半數中毒劑量，結果見表1。

表1 銀翹散、玉屏風散提取物液及對雞胚最大無毒濃度的測定

2.2 中藥提取物在雞胚水平上對甲型流感病毒毒力阻斷作用 見表2。

表2 中藥提取物在雞胚水平上對甲型流感病毒FM1株毒力阻斷作用的測定

結果表明，玉屏風散提取物 ED50：9.57 g／L，TI大于3.78，對甲型流感病毒FM1株的毒力阻斷作用在濃度為36.2 g／L時，優于其他濃度；銀翹散精簡方提取物ED50：7.41 g／L，TI大于5.28，對甲型流感病毒FM1株的毒力阻斷作用在濃度為19.58 g／L時，優于其他濃度；玉屏風散提取物對雞胚死亡的阻斷優于銀翹散精簡方提取物。

2.3 中藥提取物在雞胚水平上對甲型流感FM1株病毒毒力抑制作用 見表3。雜菌實驗結果均為陰性。

表3 中藥提取物在雞胚水平上對甲型流感FM1株病毒毒力抑制作用的測定

表3結果表明，銀翹散精簡方提取物ED50為9.91 g／L，TI大于3.95，對甲型流感病毒 FM1株的毒力抑制作用在濃度為39.15 g／L時，優于其他濃度；玉屏風散提取物ED50為10.38 g／L，TI大于3.3，對甲型流感病毒FM1株的毒力抑制作用在濃度為36.2 g／L和18.1 g／L時（兩者毒力抑制作用均等），優于濃度9.05 g／L；銀翹散提取物對雞胚死亡的阻斷優于玉屏風提取物。

3 討論

流感病毒為呼吸道常見病毒，其囊膜上的血凝素與神經氨酸酶抗原的變異頻率很高，一種形式為抗原性漂移，另一種形式為甲型流感病毒所特有的抗原性轉移，決定甲型流感病毒的治療需要依據每年的病毒分離鑒別抗原性轉移來進行疫苗的研制和藥物的選擇。當前FDA批準用于防治流感的藥物只有金剛烷胺和金剛乙胺［3，4］，但由于他們僅對甲型流感病毒有效，并很快產生耐藥株，而使其使用更加的嚴格導致應用受限。利巴韋林作為廣譜抗病毒制劑，常用做抗呼吸道病毒研究的陽性對照，有文獻報道，疾病早期使用利巴韋林霧化方法治療流感兒童，可明顯改善患兒的發熱等癥狀［5］。從細胞水平測試利巴韋林對甲型H1N1流感病毒有明顯抑制作用［6］，所以選擇利巴韋林為陽性對照。

本課題組在前期研究中，對銀翹散精簡方和玉屏風散提取優化進行了大量的研究［7］，以“三水平四因素”為正交設計醇提，通過高效液相色譜法定量分析，設立優化評價權重，得出結論70%乙醇溶媒，8倍溶媒（銀翹散精簡方），10倍溶媒（玉屏風散），提取2次，每次120 min，本研究也沿用上述實驗研究結果。

中醫藥對于外感熱病有其獨特的優勢，中醫認為外感熱病的發生和發展是正邪交蒸的過程，“祛邪扶正”為其基本的治療原則，根據中醫“審證求因”原則，在疾病病情轉變的過程中，原有癥狀的變化或新癥狀的出現，必定存在治療方法的變化，外感熱病初期使用辛涼解表藥物并在疾病過程中重用清熱解毒藥物（以銀翹散為代表方劑）［1］，當風熱輕癥向重癥轉化過程中，在治療基礎上適當扶正加用補肺實衛之品，防疾病轉變本臟重癥。對于某些患兒效果不理想，以及反復外感、病勢纏綿，對其治療配合使用補肺實衛益氣固表，比如補肺實衛益氣固表適時使用玉屏風散等藥劑口服［8］，對已有的疾病防止其進一步發展和惡化，而在疾病好轉或治愈后還要積極防止其復發及可能帶來的后遺癥。

本研究也證明了上述觀點，在中藥提取物對甲型流感病毒FM1株毒力阻斷階段，玉屏風散作用優于銀翹散精簡方，而在其毒力一直階段，銀翹散精簡方更優。兩種中藥提取物在病毒毒力阻斷、抑制作用和雞胚死亡阻斷的作用上更優于利巴韋林對照，其在動物實驗階段的研究尚在研究中。

［1］ 王雪峰.從肺毒熱論治小兒肺炎本臟重癥［J］.中醫雜志，2012，53（3）：200－202.

［2］ 胡楠楠，王雪峰.從“雙表法”論治小兒肺系外感熱病［J］.中國中西醫結合兒科學，2013，10（5）：413－414.

［3］ Cohen Stuart JW，Boucher CA，Cooper DA，et al.Summary of the III International Consensus Symposium on Combined Antiviral Therapy.［J］.Antiviral Res，1998，38 （2）：75－93.

［4］ Scholtissek C，Webster RG.Long－term stability of the anti－influenza A compounds－－amantadine and rimantadine［J］.Antiviral Res，1998，38（3）：213－215.

［5］ Rodriguez WJ，Hall CB，Welliver R，et al.Efficacy and safety of aerosolized ribavirin in young children hospitalized with influenza：a double－blind，multicenter，placebo－controlled trial［J］.J Pediatr，1994，125（1）：129－135.

［6］ 蔣虹，金光，叢喆，等.奧司他韋、利巴韋林和鹽酸金剛乙胺對甲型H1N1流感病毒的抑制作用［J］.中國比較醫學雜志，2011，21（2）：23－25.

［7］ 王文麗，王雪峰，郝歐美，等.銀翹散提取工藝及指紋圖譜初步研究［J］.遼寧中醫藥大學學報，2009，38（7）：174－176.

［8］ 任芳，李麗明.芪眾顆粒預防流行性感冒的實驗研究［J］.同濟大學學報：醫學版，2007，28（5）：40－42.