血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳實(shí)驗(yàn)影響因素分析及改進(jìn)

于樂軍 劉晨光

中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院 山東青島 266001

血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳實(shí)驗(yàn)影響因素分析及改進(jìn)

于樂軍 劉晨光

中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院 山東青島 266001

血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳實(shí)驗(yàn)是高校生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)必開實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目之一，但實(shí)驗(yàn)影響因素較多。針對(duì)影響實(shí)驗(yàn)的各種可能因素進(jìn)行分析并提出相應(yīng)改進(jìn)對(duì)策，以期為提高本實(shí)驗(yàn)的成功率提供一些可供借鑒的經(jīng)驗(yàn)。

血清蛋白；醋酸纖維薄膜；實(shí)驗(yàn)儀器

10.3969/j.issn.1671-489X.2013.12.132

作者：于樂軍，工程師，碩士，主要研究方向?yàn)樯c生物材料。

血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳法是以醋酸纖維薄膜為支持物，利用血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、?-球蛋白等各種蛋白質(zhì)的氨基酸組分、立體構(gòu)象、相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)不同，在電場(chǎng)中的移動(dòng)速率不同，通過(guò)電泳分離的一種方法[1]。因?yàn)槠渚哂形⒘俊⒖焖佟⒑?jiǎn)便、分離清晰、對(duì)樣品無(wú)吸附現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)，成為生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課必開的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目之一。但在實(shí)際的操作中，影響實(shí)驗(yàn)的因素較多，除了電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液的pH值、溶液的離子強(qiáng)度、電滲現(xiàn)象等因素外，實(shí)驗(yàn)課課前準(zhǔn)備工作是否到位以及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中學(xué)生的實(shí)驗(yàn)操作水平也直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和完整性。筆者結(jié)合多年實(shí)驗(yàn)教學(xué)經(jīng)驗(yàn)和他人研究工作，對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中需要注意和改進(jìn)的地方進(jìn)行闡明，期望為提高實(shí)驗(yàn)的成功率提供一些可供借鑒的經(jīng)驗(yàn)。

1 實(shí)驗(yàn)課課前準(zhǔn)備

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1）血清。本實(shí)驗(yàn)室一直以小牛血清代替人血清用于實(shí)驗(yàn)課程的教學(xué)，取得較好的實(shí)驗(yàn)效果。且有研究證實(shí)[2]，牛血清代替人血清進(jìn)行醋酸纖維素薄膜電泳，其結(jié)果與人血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳結(jié)果相近，實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定，重復(fù)性好。小牛血清相較于寶貴的人血清，較易獲得且儲(chǔ)存穩(wěn)定，組分純凈，沒有其他雜質(zhì)干擾，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性提供了很好的保證，用于實(shí)驗(yàn)課教學(xué)完全可以達(dá)到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵蟆?/p>

實(shí)驗(yàn)用血清標(biāo)樣的質(zhì)量問(wèn)題是直接影響電泳結(jié)果的關(guān)鍵要素[3]。用不新鮮或溶血血清標(biāo)樣進(jìn)行電泳，容易造成電泳圖譜區(qū)帶不清晰，更有甚者會(huì)出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。因此，血清應(yīng)采用清澈透亮且無(wú)溶血現(xiàn)象的標(biāo)樣，且解凍后的血清必須置于冰箱4 ℃冷藏儲(chǔ)存，每次實(shí)驗(yàn)前需仔細(xì)觀察，如出現(xiàn)渾濁或溶血現(xiàn)象要及時(shí)更換，保證血清的新鮮。

2）醋酸纖維素薄膜。醋酸纖維素薄膜的質(zhì)量對(duì)電泳的結(jié)果有很大的影響。薄膜厚薄質(zhì)地均勻，無(wú)光澤面（糙面）微孔均勻，在電泳時(shí)跑出的區(qū)帶均勻；相反，質(zhì)地不均勻，無(wú)光澤面（糙面）微孔不均勻，在電泳時(shí)會(huì)造成區(qū)帶不清晰，蛋白質(zhì)在白色斑點(diǎn)處不泳動(dòng)的現(xiàn)象，影響電泳圖譜的完整性。因此，電泳時(shí)要選擇厚薄質(zhì)地比較均勻的薄膜進(jìn)行電泳，其辨別方法是：用鑷子取干薄膜輕放在電極緩沖液的表面，如薄膜迅速濕潤(rùn)，且整條色澤深淺一致，則表明此薄膜質(zhì)地均勻；如薄膜表面出現(xiàn)深淺不一的條紋或斑點(diǎn)等，則表明此薄膜質(zhì)地不均，應(yīng)舍棄不用[4]。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

1）電泳儀電源。應(yīng)選擇電壓、電流等各項(xiàng)性能指標(biāo)均穩(wěn)定的電泳儀電源。筆者曾用即將淘汰的不穩(wěn)定電泳儀電源進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，所得到的電泳圖譜區(qū)帶分離不清，容易出現(xiàn)拖尾及跑偏等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2）電泳槽。電泳槽準(zhǔn)備時(shí)，要首先檢查槽中鉑金絲連線是否正常連接正負(fù)極插口。若掉線，電泳時(shí)會(huì)造成蛋白質(zhì)不泳動(dòng)，無(wú)法跑出相應(yīng)的區(qū)帶。制作電泳槽上的濾紙橋要根據(jù)膜支架的長(zhǎng)度和高度裁剪大小合適的濾紙，一般要采用雙層濾紙橋。另外，將濾紙橋用緩沖液濕潤(rùn)后，要用玻璃棒輕輕朝一個(gè)方向擠壓，趕掉里面的氣泡，使濾紙緊貼在膜支架上。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，盛有電極緩沖液的電泳槽應(yīng)處于封閉狀態(tài)，以防緩沖液的蒸發(fā)改變其pH值及離子強(qiáng)度，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。

3）點(diǎn)樣器。實(shí)驗(yàn)教材[1]選用載玻片作為點(diǎn)樣器，由于其長(zhǎng)端截面較厚，且玻片寬度稍比薄膜寬，點(diǎn)樣時(shí)容易使血清過(guò)多，橫跨薄膜，最終導(dǎo)致電泳后電泳圖譜蛋白質(zhì)分離不均，有明顯的邊緣效應(yīng)，且易產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象。因此，實(shí)驗(yàn)室選用小巧的蓋玻片作為點(diǎn)樣工具，其端面佷薄，容易切割，點(diǎn)樣時(shí)較易形成細(xì)條帶，增加電泳的成功率。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

1）電極緩沖液。應(yīng)根據(jù)所測(cè)樣品理化性質(zhì)，從縮減電泳時(shí)間和提高圖譜分辨率出發(fā)選擇緩沖液的種類、離子強(qiáng)度和pH。血清蛋白纖維素薄膜電泳可選用pH8.6，離子強(qiáng)度在0.06～0.09之間的巴比妥緩沖液或硼酸緩沖液，這兩種緩沖液共有的優(yōu)點(diǎn)是具有強(qiáng)揮發(fā)性，對(duì)顯色和紫外光等觀察區(qū)帶無(wú)影響。另外，用硼酸緩沖液作為電極緩沖液進(jìn)行電泳，具有使電泳圖譜更清晰完整、無(wú)毒副作用、費(fèi)用低、使用時(shí)效長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)[5-6]，其取代傳統(tǒng)的巴比妥緩沖液必將成為一種趨勢(shì)。

緩沖液配制時(shí)，為保證其離子強(qiáng)度和pH，應(yīng)用電子分析天平精確（0.001 g）稱量，定容后再用pH計(jì)校正。

2) 染色液。染色液選擇的一般原則是染料對(duì)被分離樣品有較強(qiáng)的著色力，水溶性好、穩(wěn)定、吸光度敏感，形成的染料蛋白質(zhì)復(fù)合物穩(wěn)定，且易洗脫比色[7]。實(shí)驗(yàn)通常選擇較易脫色的氨基黑10B作為染料，也可選擇麗春紅等。

3) 漂洗液。漂洗液由于用的是易揮發(fā)的乙醇和乙酸作為主要原料，所以一般臨用時(shí)配制或配好后密閉，防止其揮發(fā)，影響漂洗效果。

2 實(shí)驗(yàn)實(shí)施過(guò)程

2.1 薄膜的準(zhǔn)備

用鑷子夾取薄膜，分辨其無(wú)光澤面（糙面），無(wú)光澤面（糙面）向下一條一條放入盛有電極緩沖液的培養(yǎng)皿或大燒杯中，用鑷子輕輕地壓薄膜的表面，使其完全浸泡在電極緩沖液中，浸泡時(shí)間不少于30 min。如時(shí)間過(guò)短，則不能保證膜片上有一定量的緩沖液，難以使其恢復(fù)原來(lái)多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[2]。禁止一次夾取多條薄膜一起放入電極緩沖液中，這樣容易造成浸泡不均勻狀況，影響電泳的效果。

將浸泡好的薄膜用鑷子取出，放在濾紙上，輕輕吸取多余的水分，這個(gè)過(guò)程以薄膜“不干不濕”為標(biāo)準(zhǔn)。若吸得過(guò)干，電泳時(shí)電流無(wú)法通過(guò)，蛋白質(zhì)不泳動(dòng)，無(wú)法得到正確的圖譜；若吸后薄膜較濕，點(diǎn)樣時(shí)血清易擴(kuò)散，點(diǎn)樣線過(guò)寬，得到的電泳圖譜蛋白分離不開，且容易連成一片，影響結(jié)果觀察。

另外，實(shí)驗(yàn)操作中嚴(yán)禁用手去觸碰薄膜，以免沾污薄膜，影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

2.2 點(diǎn)樣

將吸去緩沖液的薄膜在日光燈下分辨其無(wú)光澤面（糙面）后，無(wú)光澤面（糙面）向上，放在載玻片上，保證薄膜的平穩(wěn)性，以備點(diǎn)樣。點(diǎn)樣是整個(gè)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵所在，它直接影響到電泳后圖譜的完整性和準(zhǔn)確性。因此，點(diǎn)樣前應(yīng)讓學(xué)生用蓋玻片沾取血清在濾紙上反復(fù)練習(xí)幾次，直到掌握了點(diǎn)樣技術(shù)，有把握后，再正式在薄膜上點(diǎn)樣。

正式點(diǎn)樣，用玻璃棒沾取血清，均勻地涂在蓋玻片的端面上，以“印章法”垂直地點(diǎn)在薄膜無(wú)光澤面（糙面）一端1.5～2 cm處，使樣品成一條狀涂于薄膜上。點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)做到輕、穩(wěn)、準(zhǔn)。點(diǎn)樣的量最好能控制在1 ul/cm，相當(dāng)于60～80 μg[8]。點(diǎn)樣過(guò)少，電泳后顯色不清晰；過(guò)多，則不易分離且容易拖尾。

2.3 上樣

用鑷子夾取點(diǎn)好樣的薄膜搭于電泳槽內(nèi)雙層濾紙橋上，稱為上樣。上樣時(shí)應(yīng)注意：1）點(diǎn)樣端要位于電泳槽的負(fù)（陰）極；2）無(wú)光澤面（糙面）向下；3）點(diǎn)樣線要懸空，離雙層濾紙橋有一定的距離，不能貼于濾紙橋上；4）薄膜要拉直，中間不能有彎曲；5）薄膜要緊貼于濾紙橋上，中間不能有氣泡；6）相鄰薄膜間不能靠得太近，要留有2～5 mm左右的空隙；7）上樣后，要蓋上電泳槽的蓋子平衡5～10 min，使薄膜完全濕潤(rùn)后，再進(jìn)行電泳。

2.4 電泳

將電泳儀電源與電泳槽的正負(fù)極正確連接后，打開電泳儀電源進(jìn)行通電電泳。因?yàn)槭褂玫碾娪緝x和電泳槽不同，以及每次實(shí)驗(yàn)所上樣的薄膜數(shù)量也不一樣，所以不能直接照搬實(shí)驗(yàn)教材[1]所給的電壓110 V，電流0.4～0.6 mA/cm膜寬（薄膜數(shù)量的總寬度），通電時(shí)間45～60 min進(jìn)行電泳。實(shí)踐也證明，這樣電泳所得到的圖譜蛋白分離不好，效果較差。因此，應(yīng)從實(shí)際出發(fā)，根據(jù)濾紙橋正負(fù)極之間的寬度和所放薄膜數(shù)量的多少來(lái)計(jì)算所用的電壓和電流。經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，電壓一般穩(wěn)定在130 V，電流控制0.6～0.8 mA/cm膜寬。由于本實(shí)驗(yàn)一直安排在秋季末進(jìn)行，天氣比較涼，所以電泳時(shí)間應(yīng)當(dāng)適當(dāng)延長(zhǎng)，控制在70～90 min，所得到的電泳圖譜分離效果比較好。

電泳過(guò)程中，電極緩沖液的離子強(qiáng)度和pH的改變會(huì)影響到血清蛋白的分離效果。緩沖溶液的離子強(qiáng)度越高，帶電質(zhì)點(diǎn)的泳動(dòng)速度越慢，反之則越快；pH距等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，質(zhì)點(diǎn)所帶電荷越多，泳動(dòng)速度越快，反之則越慢[9]。有研究[10]證實(shí)：通過(guò)混合正負(fù)極電極緩沖液的方法，能顯著延長(zhǎng)緩沖液的使用時(shí)效。因此，每次電泳后，應(yīng)及時(shí)檢測(cè)緩沖液pH，特別是陽(yáng)極（正極）pH的變化，電泳2～3次后，將正負(fù)極緩沖液混合后使用，并觀察實(shí)驗(yàn)后圖譜的分離效果，如分離不好，應(yīng)全部倒掉，重新配制新的電極緩沖液，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外，電泳開始后，嚴(yán)禁再取放薄膜，以防觸電，發(fā)生事故。

2.5 染色

染色時(shí)應(yīng)將薄膜完全浸在染色液里，并時(shí)不時(shí)晃動(dòng)裝有染色液的培養(yǎng)皿，使其充分染色。如染色多條，要避免薄膜之間相互重疊，否則會(huì)造成染色不均，脫色后背景色淺的情況。染色時(shí)間一般應(yīng)掌握在10 min左右。用過(guò)的染色液可以回收重復(fù)利用，節(jié)約資源。但有研究[11]發(fā)現(xiàn)，染色液重復(fù)使用次數(shù)過(guò)多，會(huì)使蛋白區(qū)帶染色不均，出現(xiàn)空泡樣現(xiàn)象。因此，一旦出現(xiàn)此種情況，應(yīng)立即重新配制染色液。

2.6 漂洗

漂洗時(shí)應(yīng)采用“少量多漂”或“連續(xù)漂洗”[4]的方法。“少量多漂”針對(duì)個(gè)組學(xué)生，每次用少量能沒過(guò)薄膜的漂洗液漂洗，一般3～4次就能漂洗干凈。“連續(xù)漂洗”針對(duì)多組學(xué)生，放置幾個(gè)盛有漂洗液的培養(yǎng)皿，依次排開，學(xué)生連續(xù)漂洗。這兩種方法的運(yùn)用，都能達(dá)到漂洗的效果，且節(jié)約資源，保護(hù)環(huán)境。

3 結(jié)束語(yǔ)

綜上所述，諸多因素影響著血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳，實(shí)驗(yàn)中任何一個(gè)環(huán)節(jié)的處理不當(dāng)，都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和完整性。為了獲得好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，滿足實(shí)驗(yàn)教學(xué)目的，達(dá)到實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果，除了教輔人員認(rèn)真進(jìn)行課前準(zhǔn)備，做好預(yù)實(shí)驗(yàn)外，還需要課前讓學(xué)生提前預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，了解實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)；課上認(rèn)真規(guī)范學(xué)生操作，把握每個(gè)操作環(huán)節(jié)；課后及時(shí)總結(jié)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)。相信注意了以上細(xì)節(jié)，血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳的成功率將大大提高。

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An Analysis of Factors that Influence Cellulose Acetate Membrane Electrophoresis Experiment of Serum Protein and Its Improvements

Yu Lejun, Liu Chenguang

The cellulose acetate membrane electrophoresis experiment of Serum protein is one of the required biochemical experiments at university. As there exist many factors influencing the experiment, this paper is to focus on the overall analysis of each possible influencing factor and the improvement measures of the experiment. This paper aims to offer useful suggestions for experimenters and help to conduct a successful cellulose acetate membrane electrophoresis experiment of serum protein.

Serum protein; acetate film; experimental apparatus

Q5-33 G642.423

B

1671-489X(2013)12-0132-03