實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)蔬菜病原細(xì)菌技術(shù)

陳 璐 謝學(xué)文 石延霞 李寶聚

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

蔬菜細(xì)菌性病害是由植物病原細(xì)菌引起的一類病害，具有侵染途徑多樣、傳播速度快、防治困難等特點(diǎn)，是蔬菜病害防治的重點(diǎn)。傳統(tǒng)的病原細(xì)菌檢測(cè)采用培養(yǎng)基分離純化與致病性鑒定的方法，隨后血清學(xué)技術(shù)的應(yīng)用使得病原細(xì)菌的快速檢測(cè)成為可能（Schaad & Frederick，2002）。

Rasmussen 和Wulff 于1991年首次采用PCR 方法檢測(cè)植物病原菌（Rasmussen & Wulff，1991）及感染種子（Prosen et al.，1991），推動(dòng)基于PCR 方法的植物病原菌檢測(cè)技術(shù)快速發(fā)展。20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來(lái)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)可以對(duì)靶標(biāo)核酸進(jìn)行精確定量檢測(cè)，突破了傳統(tǒng)PCR 技術(shù)只能對(duì)目標(biāo)核酸進(jìn)行定性檢測(cè)的局限，因而受到越來(lái)越多的重視，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用在植物病害診斷等不同的研究領(lǐng)域。近年來(lái)，多種蔬菜病原細(xì)菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法先后建立，為蔬菜病原細(xì)菌的研究和病害的防治提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)原理及優(yōu)點(diǎn)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)的原理是在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR 進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。常規(guī)PCR 中，擴(kuò)增產(chǎn)物（擴(kuò)增子）是通過(guò)終點(diǎn)法來(lái)分析檢測(cè)，即PCR 反應(yīng)結(jié)束后，DNA 通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行成像分析（Klein，2002）。

相對(duì)常規(guī)PCR 而言，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法檢測(cè)植物病原菌的主要優(yōu)點(diǎn)包括：① 實(shí)時(shí)性，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 在反應(yīng)體系中加入熒光分子，熒光信號(hào)與DNA 量的增加成對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而在反應(yīng)過(guò)程中進(jìn)行累積擴(kuò)增產(chǎn)物的分析和檢測(cè)；② 靈敏度高，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 有較寬的動(dòng)態(tài)范圍，相較于常規(guī)PCR 而言具有較高的檢測(cè)靈敏度；③ 反應(yīng)封閉，由于PCR 反應(yīng)和檢測(cè)均在反應(yīng)管中進(jìn)行，大大降低了樣品的污染和假陽(yáng)性的機(jī)率；④ 操作簡(jiǎn)易，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果無(wú)需通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)評(píng)估，節(jié)省了試驗(yàn)時(shí)間，提高了試驗(yàn)效率；⑤ 特異性強(qiáng)，不受植物癥狀的限制，能快速準(zhǔn)確檢測(cè)到植物病原菌；⑥ 高處理量，自動(dòng)化的PCR檢測(cè)系統(tǒng)具有較高的處理量，為大規(guī)模的植物病害診斷提供新的思路。

2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 在幾種重要蔬菜病原細(xì)菌檢測(cè)方面的應(yīng)用

2.1 假單胞菌屬（Pseudomonas）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)

植物病原假單胞菌（Pseudomonas）導(dǎo)致許多植物病害，如黃瓜細(xì)菌性角斑病（Pseudomonas syringapv.lachryman）、番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病（P.syringaepv.tomato）、平菇褐斑病（P.tolaasii）、萵苣軟腐病（P.cichorii）、萵苣褐腐病（P.marginalispv.marginalis）等（Schaad et al.，2001）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR可用來(lái)對(duì)寄主植物組織內(nèi)潛伏侵染的病原菌或?qū)ΨN植環(huán)境中潛伏侵染的病原菌進(jìn)行定量檢測(cè)。如：菊苣假單胞菌（P.cichori）對(duì)結(jié)球期的萵苣造成侵染并引起典型的軟腐病癥狀的濃度為100 cfu·mL-1，Cottyn 和Baeyen（2011）基于hrcRST致病基因片段建立了一種靈敏的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)灌溉水中菊苣假單胞菌的方法，檢測(cè)灌溉水中菊苣假單胞菌的靈敏度為1 cfu·mL-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于該病害的發(fā)病閾值，從而為萵苣軟腐病的早期預(yù)測(cè)和預(yù)警提供信息。

多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)可以特異性檢測(cè)多種病原菌，如基于丁香假單胞菌屬（P.syringae）細(xì)胞色素氧化酶輔酶基因序列差異建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)，可以特異檢測(cè)8種丁香假單胞菌致病變種病原菌（syringae，tomato，maculicola，tabaci，atropurpurea，phaseolicola，pisi，glycinea），檢測(cè)靈敏度為100 fg，即4.5×103cfu·mL-1，提高了檢測(cè)效率，并可以直接定量接種丁香假單胞菌番茄致病變種（P.syringaepv.tomato）的番茄離體葉片中病原菌DNA 的含量（Xu & Tambong，2011）。

2.2 黃單胞菌屬（Xanthomonas）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)

黃單胞菌屬（Xanthomonas）是薄壁菌門(mén)的一個(gè)成員，革蘭陰性菌，該屬的細(xì)菌成員都是植物病原菌，可以危害120 多種單子葉植物和270 多種雙子葉植物，引起許多重要的植物病害，導(dǎo)致植物葉枯、壞死、萎蔫等癥狀；模式種是野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris），俗稱甘藍(lán)黑腐病菌。該病原菌寄主廣泛，幾乎可侵染十字花科的全部植物，引起十字花科黑腐病，葉片邊緣形成典型的V 字形黃褐色病斑，是危害十字花科植物的一種重要病原菌。相對(duì)于普通PCR，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的高靈敏性使得諸如十字花科黑腐病等種傳細(xì)菌性病害的研究有所突破。Berg 等（2006）建立了蕓薹屬蔬菜多種野油菜黃單胞菌（X.campestris）的致病變種（Campestris，aberrans，Armoraciae，Raphani）帶菌種子的高靈敏性實(shí)時(shí)熒光定量PCR，該方法可以檢測(cè)到10 000個(gè)種子中的1個(gè)帶菌種子，比常規(guī)PCR 靈敏度高100倍，可快速檢測(cè)以上幾種野油菜黃單胞菌的菌落、十字花科蔬菜的帶菌種子和帶菌植株中的病原菌，為種植戶和種業(yè)商戶提供防治黑腐病的可靠方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 還可以通過(guò)測(cè)定寄主植物受侵染時(shí)基因的變化來(lái)研究寄主對(duì)病原菌的抗病分子機(jī)制。如在花椰菜對(duì)甘藍(lán)黑腐病菌抗病分子機(jī)制的研究中，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)所構(gòu)建的cDNA 文庫(kù)中相應(yīng)的12個(gè)不同功能的基因表達(dá)譜進(jìn)行表達(dá)量的監(jiān)測(cè)，從而得到花椰菜中參與甘藍(lán)黑腐病抗病分子機(jī)制的相關(guān)基因（Jiang et al.，2011）。

2.3 歐文氏菌屬（Erwinia）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)

歐文氏菌屬（Erwinia）是人類最先發(fā)現(xiàn)的植物病原細(xì)菌，由歐文氏菌引起的細(xì)菌性軟腐病在世界各地都有廣泛發(fā)生和報(bào)道。主要癥狀是果實(shí)或葉片基部變軟、腐爛、伴有惡臭，可以是生長(zhǎng)期病害，也可以是貯藏期病害。

歐文氏菌屬主要引起瓜類細(xì)菌性枯萎病（E.tracheiphila），馬鈴薯、蘿卜、大白菜等蔬菜的軟腐病（E.carotovara）。Atallah 和Stevenson（2006）利用實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)檢測(cè)了5種馬鈴薯病原菌（E.carotovorasubsp.carotovoraand subsp.Atroseptica、Phytophthora infestans、Phytophthora erythroseptica、Pythium ultimum、Fusarium sambucinum），檢測(cè)的靈敏度達(dá)到0.5 pg，可直接從商業(yè)馬鈴薯塊莖提取液中檢測(cè)到1 ng 的馬鈴薯軟腐病菌（E.carotovora），為馬鈴薯采收后的商業(yè)貯存能力預(yù)測(cè)提供方法。

2.4 其他重要細(xì)菌性病害實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)

應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)其他蔬菜重要病原細(xì)菌也有較多相關(guān)報(bào)道，其中研究最為深入的是瓜類細(xì)菌性果斑病菌（Acidovorax citrulli）。該病原之前被命名為嗜酸菌燕麥種西瓜亞種（Acidovora avenaesubsp.Citrulli）。燕麥?zhǔn)人峋鷮俨≡谋Ｊ匦蛄休^易尋找（Schaad &Frederick，2002），故經(jīng)典的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系基于ITS 等保守序列設(shè)計(jì)相關(guān)的PCR引物（Schaad et al.，2000）。近年來(lái)，隨著免疫學(xué)和選擇性培養(yǎng)基等富集方聯(lián)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)病原菌日漸成熟，定量PCR 的靈敏度得到進(jìn)一步提高。應(yīng)用免疫學(xué)方法，如磁珠捕獲法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)相結(jié)合，檢測(cè)瓜類果斑病菌靈敏度可達(dá)到10 cfu·mL-1，病種的檢出率為0.02%，較單一實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的靈敏度提高了10倍（Ha et al.，2009）。利用選擇性培養(yǎng)基，如應(yīng)用EBB 和EBBA 培養(yǎng)果斑病菌，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法檢測(cè)果斑病菌，病種的檢出率為0.1%（Zhao et al.，2009），可以在一定程度上排除雜菌的影響，進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏性，具有較好的應(yīng)用前景。

青枯病是重要的植物病原細(xì)菌，影響多種農(nóng)作物，控制青枯病重要的是早期的檢測(cè)和預(yù)防。利用免疫磁珠分離（IMS）和磁珠捕獲雜交（MCH）的方法，純化馬鈴薯青枯病菌（Ralstonia solanacearum）R3Bv2株系的細(xì)胞和DNA，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)相結(jié)合，可將實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法1 000 cfu·mL-1的檢測(cè)閾值提高到 500 cfu·mL-1（Ha et al.，2012）。Weller等（2000）首次利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法檢測(cè)馬鈴薯塊莖提取液中的青枯菌，檢測(cè)的閾值只能達(dá)到1×105～1×106cfu·mL-1。對(duì)于青枯病菌等土傳細(xì)菌性病害，實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以直接檢測(cè)土壤樣本中的微量目標(biāo)病原菌的量，而省去了病原菌的分離培養(yǎng)。Chen 等（2010）建立了單基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增方法，對(duì)番茄病組織和種植環(huán)境土壤中的青枯病菌直接檢測(cè)限能達(dá)到100 cfu·g-1，而采用普通PCR 方法對(duì)茄子青枯病的根圍土壤進(jìn)行檢測(cè)的最低檢測(cè)閾值是400 cfu·g-1（Ramesh et al.，2011）。

番茄潰瘍病菌（Clavibacter michiganensissubsp.Michiganensis）可以在番茄種子間傳播而導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。利用MCH 方法純化番茄潰瘍病病原菌核酸，解除病組織和土壤溶液中PCR 反應(yīng)抑制物的影響，可以使多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的靈敏度達(dá)到105cfu·mL-1（Johnson & Walcott，2012）。Cho 等（2012）建立了檢測(cè)番茄和紅辣椒上潰瘍病菌（C.michiganensissubsp.michiganensis）的定量PCR 方法，該方法可檢測(cè)到該病原菌的單克隆，靈敏性進(jìn)一步提高，可應(yīng)用于該病原菌低濃度帶菌種子的檢測(cè)，為該病害的潛在威脅提供預(yù)警。

3 展望

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法快速、靈敏且特異性強(qiáng)，已被廣泛應(yīng)用于植物細(xì)菌性、真菌性以及病毒性病原的檢測(cè)。蔬菜病原細(xì)菌多為種傳，少量甚至微量的病原菌在合適的氣候條件下能夠很快地傳播，導(dǎo)致嚴(yán)重的病害流行，故高靈敏性的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對(duì)帶菌種子的檢測(cè)技術(shù)尤為重要。隨著蔬菜產(chǎn)量的連年升高，蔬菜細(xì)菌性病害的大規(guī)模檢測(cè)也越來(lái)越受到重視，自動(dòng)化的熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)具有較高的處理量，為多種病原菌的同時(shí)檢測(cè)提供基礎(chǔ)。另外，雖然實(shí)時(shí)熒光定量PCR 還處于初級(jí)階段，但其對(duì)于mRNA 的定量檢測(cè)有較大的潛力，可以用于病原菌與寄主間的互作或病原菌對(duì)環(huán)境變化響應(yīng)的研究。同樣，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 為單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的研究提供了可靠的方法，可用于特定病原菌基因群體的研究（Schena et al.，2004）。然而，在蔬菜病原細(xì)菌的檢測(cè)應(yīng)用中，相比普通PCR 而言，其可用的熒光引物和探針仍然受到限制，且染料和探針的價(jià)格較為昂貴；而實(shí)時(shí)熒光定量PCR 最大的局限在于依然無(wú)法區(qū)分檢測(cè)材料的死活，而自然條件下的核酸酶在很多情況下不能完全降解死亡細(xì)胞。雖然選擇性培養(yǎng)基聯(lián)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的方法可以定量檢測(cè)存活細(xì)胞，但其周期較長(zhǎng)（細(xì)菌培養(yǎng)耗時(shí)1～4 d），快速有效鑒定植物病原菌死活及檢測(cè)病原菌總量的方法尚未建立。隨著技術(shù)的發(fā)展、試驗(yàn)材料成本的降低以及技術(shù)之間交叉利用的快速發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 在蔬菜病原細(xì)菌檢測(cè)方面將有更廣泛更深入的應(yīng)用前景。

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