腰椎間盤退變基因治療的研究進(jìn)展

李 翔，李新志

腰椎間盤退變 (LDD)是引起一系列脊柱疾病的主要原因，但現(xiàn)有的保守治療及手術(shù)治療均是針對(duì)患者臨床癥狀［1］，并不真正符合LDD的發(fā)病機(jī)制及病理生理學(xué)特點(diǎn)。為尋求更好的治療方法，基因治療逐漸進(jìn)入人們的視線并成為近些年研究的熱點(diǎn)。LDD基因治療主要涉及目的基因的篩選、載體的選擇、轉(zhuǎn)染方法和轉(zhuǎn)基因的表達(dá)調(diào)控等，現(xiàn)就其研究進(jìn)展綜述如下。

1 基因治療的必要性

LDD是由基因因素和環(huán)境因素相互作用的多因素疾病。Battié等［2－3］對(duì)不同環(huán)境下成長(zhǎng)的同卵雙胞胎進(jìn)行的長(zhǎng)期研究顯示，LDD可能主要受遺傳因素的影響，環(huán)境因素的影響可能非常有限。Patel等［4］通過(guò)人口數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)對(duì)猶他州的1 264例LDD患者進(jìn)行健康和家譜分析，發(fā)現(xiàn)LDD患者有明顯的家族聚集性。Kepler等［5］認(rèn)為許多特定的遺傳風(fēng)險(xiǎn)基因與LDD密切相關(guān)，個(gè)人發(fā)生LDD風(fēng)險(xiǎn)的75%可歸因于遺傳因素。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為基因治療主要針對(duì)的是經(jīng)典遺傳性疾病，但基因治療技術(shù)的進(jìn)步揭示了其在后天獲得性慢性疾病中的潛在用途。由LDD引發(fā)的腰椎疾病也是基因治療的良好適應(yīng)證［6］?；蛑委煹闹饕椒ㄊ抢幂d體將治療性基因轉(zhuǎn)染到靶細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞就會(huì)持續(xù)產(chǎn)生治療所需的產(chǎn)物。雖然基因治療的技術(shù)要求復(fù)雜，但一旦成熟應(yīng)用于臨床，可以想象，一次基因或蛋白因子注射會(huì)給患者帶來(lái)多么大的好處。

2 目的基因

對(duì)于基因治療而言，找到與疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的目的基因是關(guān)鍵問(wèn)題。目前，常用候選基因的方法來(lái)識(shí)別與LDD相關(guān)的目的基因，并發(fā)揮了一定的作用。目前研究熱門的候選基因主要有以下幾種。

2.1 細(xì)胞外基質(zhì)蛋白 (ASPN)基因

ASPN基因因與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)而成為L(zhǎng)DD的候選基因。Song等［7］應(yīng)用微點(diǎn)陣和原位雜交技術(shù)對(duì)中國(guó)和日本LDD隊(duì)列進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)ASPN基因的表達(dá)隨年齡增長(zhǎng)和腰椎間盤的退變而升高，其中D14基因型占多數(shù)，且與LDD具有高度相關(guān)性。薈萃分析結(jié)果顯示，在兩個(gè)隊(duì)列中，個(gè)人攜帶至少一個(gè)D14等位基因發(fā)生LDD風(fēng)險(xiǎn)的比值比分別為1.66和1.79，表明東亞人群ASPN基因與LDD密切相關(guān)。

2.2 軟骨中間層蛋白 (CILP)基因

CILP是關(guān)節(jié)軟骨的重要結(jié)構(gòu)，與骨關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)。Wang等［8］利用兔子腰椎退變動(dòng)物模型對(duì)CILP基因在腰椎間盤組織中的表達(dá)和表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行研究表明，正常情況下CILP基因在兔子腰椎間盤組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平隨兔齡增長(zhǎng)及腰椎間盤的退變程度加重而持續(xù)上調(diào);骨形態(tài)發(fā)生蛋白 －2(BMP－2)通過(guò)激發(fā)CILP基因啟動(dòng)子的活性誘導(dǎo)CILP的表達(dá)，并且兔齡越大誘導(dǎo)作用越強(qiáng)。用基因干擾技術(shù)對(duì)表達(dá)Smad1蛋白的基因進(jìn)行敲除，則BMP－2對(duì)CILP的誘導(dǎo)作用消失。據(jù)此推測(cè)，LDD程度、年齡和BMP－2均能對(duì) CILP基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，而B(niǎo)MP－2對(duì)CILP表達(dá)的調(diào)節(jié)作用則通過(guò)激活Smad1信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)，探討基因表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制也是研究LDD基因治療的重要方向。

2.3 骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (BMP)基因

BMP是一種多功能生長(zhǎng)因子，是具有成骨誘導(dǎo)作用的特殊蛋白質(zhì)，可以刺激間充質(zhì)干細(xì)胞分化為多種細(xì)胞。BMP家族成員眾多，目前研究較多的是BMP－2基因。Leckie等［9］采取穿刺造模并體內(nèi)注射的方法，以2型腺病毒相關(guān)病毒為載體并裝載BMP－2基因，對(duì)兔腰椎間盤細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并將其作為治療組，另設(shè)空白對(duì)照組;通過(guò)MRI檢查和組織學(xué)檢查證明兩組兔子均因穿刺而造成LDD，在12周時(shí)，治療組腰椎間盤內(nèi)Ⅱ型膠原含量迅速增加，組織學(xué)形態(tài)也得到恢復(fù)，而對(duì)照組卻無(wú)此現(xiàn)象。提示BMP－2基因治療或許可作為L(zhǎng)DD的一種治療手段。

2.4 生長(zhǎng)分化因子－5(GDF－5)基因

既往研究認(rèn)為GDF－5基因與骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)，但近年研究發(fā)現(xiàn)其與骨骼高度及膝骨關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)［10］，因而成為了LDD的候選基因。Williams等［11］對(duì)北歐人群進(jìn)行的大樣本量薈萃分析結(jié)果證實(shí)，含GDF－5 T等位基因的北歐女性更容易發(fā)生腰椎間隙變窄和骨贅，與LDD密切相關(guān)。Liang等［12］利用腺病毒作為載體，將分別搭載了 GDF－5基因 (治療組)和熒光素酶基因 (對(duì)照組)的腺病毒注射到LDD小鼠腰椎間盤，2周后，治療組小鼠的椎間高度持續(xù)增加，組織學(xué)檢查結(jié)果顯示治療組小鼠腰椎間盤的組織學(xué)結(jié)構(gòu)明顯改善，而對(duì)照組無(wú)明顯改善。提示GDF－5基因可能是恢復(fù)退變腰椎間盤功能的候選基因。

3 載體

通常情況下，外源性基因很難被靶細(xì)胞所接受，這就需要載體把治療性基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入靶細(xì)胞內(nèi)，載體一般分兩種，即病毒性載體和非病毒性載體。

3.1 病毒性載體 病毒是非常高效的載體，因此，在進(jìn)行基因治療研究時(shí)通常選用病毒作為載體，如慢病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒 (AAV)等。雖然研究表明此類載體基本上是安全的，但人們還是對(duì)其表示擔(dān)憂。

3.1.1 慢病毒載體 慢病毒載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒 (HIV－1)為基礎(chǔ)的基因治療載體，目前研究較多［13］。HIV－1型慢病毒載體具有容納較大外源性基因片段、可瞬時(shí)表達(dá)、相關(guān)指標(biāo)便于檢測(cè)、表達(dá)穩(wěn)定、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株方便通過(guò)抗生素篩選等優(yōu)點(diǎn)，且引起宿主的免疫反應(yīng)小，安全性較好。胡明等［14］利用慢病毒為載體將干擾片段 (siRNA)轉(zhuǎn)染人胚腰椎間盤髓核細(xì)胞，并使髓核細(xì)胞的上皮膜蛋白－1基因表達(dá)沉默，成功構(gòu)建了人胚腰椎間盤髓核上皮膜蛋白－1基因低表達(dá)細(xì)胞模型。

3.1.2 腺病毒載體 腺病毒載體是目前在轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域應(yīng)用較廣的病毒載體之一。Liang等［12］通過(guò)體內(nèi)針刺注射的辦法將分別搭載了熒光素酶基因和GDF－5基因的腺病毒載體注射到小鼠腰椎間盤，然后分別在1、2、4、8周后處死小鼠并進(jìn)行腰椎間盤組織學(xué)和生化檢測(cè);結(jié)果顯示，腺病毒存活且能高效地向腰椎間盤細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因，轉(zhuǎn)基因表達(dá)持續(xù)6周以上。表明腺病毒可能是LDD基因治療的合適載體。

3.1.3 AAV載體 研究認(rèn)為，AAV載體較腺病毒載體具有更少的免疫原性，目前為止仍未發(fā)現(xiàn)其與人類或哺乳動(dòng)物的任何疾病有關(guān)，且AAV載體的大小可根據(jù)搭載基因的性狀進(jìn)行調(diào)節(jié)。Lattermann等［15］將攜帶不同標(biāo)記基因的AAV載體注射到24只兔子腰椎間盤組織，并對(duì)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)及機(jī)體對(duì)AAV載體的細(xì)胞體液免疫進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示，AAV載體能高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)腰椎間盤細(xì)胞并產(chǎn)生了很好的轉(zhuǎn)基因表達(dá)作用，即使是在一個(gè)低水平的體液免疫環(huán)境下，總轉(zhuǎn)基因效率約相當(dāng)于腺病毒載體的50%。出于人們對(duì)腺病毒載體安全問(wèn)題的擔(dān)憂，AAV載體可能是更好的病毒性載體。

3.2 非病毒性載體 非病毒性載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)較病毒性載體更為安全、簡(jiǎn)單［16］，但非病毒性載體的轉(zhuǎn)染率較病毒性載體低，而超聲微泡技術(shù)及脂質(zhì)體技術(shù)等的出現(xiàn)極大地提高了非病毒性載體的轉(zhuǎn)染率。

3.2.1 超聲微泡技術(shù) 超聲微泡技術(shù)是近年應(yīng)用于基因治療的非病毒性載體技術(shù)之一，其利用超聲微泡造影劑攜帶藥物或外源性基因進(jìn)入靶點(diǎn)，再在超聲環(huán)境下使其破裂并釋放藥物或基因。Nishida等［17］將分別加載了綠色熒光蛋白 (GFP)和熒光素酶的質(zhì)粒與超聲微泡造影劑混合，注入SD大鼠腰椎間盤后將超聲施加于注射部位 (超聲組)，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，于1、3、6、12、24周后處死大鼠，將切下的髓核組織用于轉(zhuǎn)基因評(píng)估，以正常腰椎間盤組織作對(duì)照;結(jié)果顯示，基因轉(zhuǎn)染7 d后就能在GFP轉(zhuǎn)染的髓核觀察到相當(dāng)數(shù)量的GFP陽(yáng)性細(xì)胞，超聲組熒光素酶活性約是空白對(duì)照組的11倍，且該方法介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)至少持續(xù)24周。Nishida等［17］進(jìn)行的研究也是第一次以非病毒性載體在體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染腰椎間盤細(xì)胞的報(bào)道，說(shuō)明超聲微泡技術(shù)在LDD基因治療中具有很大的潛在作用。

3.2.2 脂質(zhì)體 脂質(zhì)體是近年應(yīng)用較多的非病毒性載體，其主要成分是磷脂，與細(xì)胞膜中的天然脂質(zhì)膜具有非常相似的生物學(xué)特性［18］。脂質(zhì)體具有良好的生物相容性、生物降解性，且無(wú)免疫原性，是一種對(duì)受體細(xì)胞無(wú)明顯毒性的人工組裝囊泡。脂質(zhì)體制劑對(duì)人體的安全性已獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局的認(rèn)同。Morrey等［19］對(duì)多種脂質(zhì)體相關(guān)載體進(jìn)行了篩選，通過(guò)對(duì)它們?cè)隗w外對(duì)腰椎間盤的細(xì)胞毒性、轉(zhuǎn)染率以及適宜轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體與蛋白質(zhì)和多胺復(fù)合體(TransIT－LT1)可能是LDD基因治療比較好的非病毒性載體。

4 RNA干擾 (RNAi)技術(shù)

腰椎間盤是體內(nèi)最大的無(wú)血管組織，其髓核被密封在兩端為終板軟骨、四周為致密纖維環(huán)的“密閉”空間。腰椎間盤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧的供給主要通過(guò)終板軟骨被動(dòng)擴(kuò)散，這導(dǎo)致了髓核組織營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧的匱乏，尤其是腰椎間盤中心［20］，氧分壓低而乳酸含量高。因此，耗能少和需要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)少的治療方法也許更適合LDD的治療。近年來(lái)出現(xiàn)的針對(duì)特定基因并使其表達(dá)沉默的RNAi技術(shù)能使處于退化狀態(tài)的腰椎間盤相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，從而阻止腰椎間盤的退行性變。RNAi技術(shù)更注重預(yù)防腰椎間盤的退變，理論上講，還可以逆轉(zhuǎn)腰椎間盤的退變進(jìn)程［6］。RNAi技術(shù)作為一種重要的防治手段已被廣泛應(yīng)用于抑制特異基因的表達(dá)及其功能的研究［21］。Kakutani等［22］第一次用人類和大鼠髓核細(xì)胞做離體試驗(yàn)，成功地沉默了SD大鼠和脊柱側(cè)凸個(gè)體髓核細(xì)胞中的靶基因。Seki等［23］通過(guò)體外轉(zhuǎn)染及體內(nèi)注射，利用對(duì)解整合素－金屬蛋白酶－5(ADAMTS－5)特異的siRNA轉(zhuǎn)染兔髓核細(xì)胞，結(jié)果顯示兩種方式都有效地沉默了兔髓核細(xì)胞 ADAMTS－5基因。張濤等［24］采用RNAi技術(shù)成功地沉默了大鼠腰椎間盤髓核細(xì)胞的P53及P21基因，很大程度上改善并延緩了大鼠腰椎間盤組織的退變進(jìn)程。RNAi技術(shù)作為一種新型的防治LDD的基因治療手段，可以有效地抑制髓核細(xì)胞特定基因的表達(dá)，還可用以探索特定基因的作用及基因間的相互關(guān)系。

5 小結(jié)

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基因治療LDD將會(huì)是未來(lái)的方向，且當(dāng)前研究也取得了令人矚目的成就，但大多研究仍停留于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，真正應(yīng)用于臨床還有許多困難要克服:(1)腰椎間盤是人體內(nèi)最大的無(wú)血管組織，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及氧供應(yīng)非常有限，尤其是腰椎間盤中心［20］，造成腰椎間盤再生困難。從理論上說(shuō)，腰椎間盤只能支持少量能耗高的代謝活躍細(xì)胞，而促進(jìn)其再生和刺激細(xì)胞外基質(zhì)合成的方法則不容易成功。(2)LDD的發(fā)病機(jī)制和腰腿痛機(jī)制仍未完全闡明，有待進(jìn)一步深入研究，進(jìn)而選擇最佳目的基因。 (3)基因治療的安全性及遠(yuǎn)期效果也有待于進(jìn)一步深入研究。期望未來(lái)幾年基因治療相關(guān)的研究會(huì)出現(xiàn)新突破，從而為L(zhǎng)DD的基因治療提供更加安全可靠的方法。

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