不容忽視的潛在的人畜共患病－豬戊型肝炎

王 衡，寧章勇，梁煥斌，古洪浪，張桂紅

（華南農業大學獸醫學院，廣東 廣州510642）

2003年，有報道稱日本發現兩例戊型肝炎（Hepatitis E，HE）感染病例，1例53歲患者盡管早期出現嚴重的肝炎癥狀，但很快恢復健康；另1例70歲患者出現同樣的初期肝炎癥狀，但隨后出現肝昏迷并死亡于突發性肝衰竭。病原分離得知兩例患者感染的為Ⅳ型肝炎病毒；流行病學調查表明，在3個月內2人共同食用5次未熟的野豬肝［1］。另外，香港明報新聞網 （http：／／www．chinanews．com／ga／2010／12－30／2758109．shtml）在2010 年年末報道了這樣一則新聞，稱香港食物安全中心表示，香港的戊型肝炎由1998年起逐漸上升，至2010年已達100宗，數字為歷來的新高。患者通常有發燒、嘔吐、眼黃及尿液呈茶色等病征，報道同時指出，戊型肝炎患者多曾去過高危地方，或曾食用貝或豬肝等食物，以致染病。雖然兩則報道相距7年，但在這7年里，世界各地尤其是發展中國家類似的報道數不勝數。這提示我們戊型肝炎病毒正隱蔽在家畜、家禽及野生動物體內，并悄悄地“潛伏”在我們周圍。

戊型肝炎是引起暴發性及散發性肝炎的主要原因，血清學調查表明［2］，世界1／3人口曾經感染過戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）。無論是在發展中國家還是在發達國家，戊型肝炎都不再是一種罕見的疾病，在發達國家每年約有1．3萬～2．6萬人慢性肝炎患者因合并HE死亡［3］。戊型肝炎具有比較明顯的年齡特異性，對于老年人、慢性肝炎患者及孕婦危害性尤高，孕婦感染HEV的死亡率可達20%［4］。眾多研究表明，豬HEV可能是人感染HEV的主要來源之一，因此，積極開展動物源性HEV的研究將會對公共衛生及動物源性食品安全的實施具有巨大的幫助。

1 豬戊型肝炎病原學與流行病學

HEV屬于單股正鏈RNA病毒，是戊肝病毒屬的惟一成員。目前已經鑒定出兩種截然不同的HEV，一種是感染哺乳動物的HEV，包括4個基因型，可以引起人類的急性肝炎，目前認為豬及其他多種動物可能作為其重要的儲存器；一種是感染禽類的HEV，只含有1個基因型，可引起雞出現肝脾腫大癥狀。其中前者，被認為可能是一種豬源的人獸共患病，也是目前動物源性人獸共患病的研究熱點之一，該病毒具有一個7．2kb的基因組，含有3個開放閱讀框（ORFs），分別為編碼具有復制功能的多聚蛋白的ORF1、編碼病毒衣殼蛋白的ORF2以及編碼具有調節細胞蛋白激酶活性的ORF3。

根據病毒基因的變異性，我們將感染哺乳動物的HEV分為4個基因型［5］：分別是以亞洲和非洲分離株為主的Ⅰ型；以墨西哥株及少量非洲散發疫區分離株為主的Ⅱ型；以分離自發達國家并可以是人源或豬源分離株為主的Ⅲ型；以亞洲分離株為主，尤其是主要發現于中國及日本的基因型Ⅳ型。

目前在我國大部分地區［6－8］，不但在人群中可以檢測到高比例HEV陽性血清的存在，同時在家畜（豬、馬、牛、羊）及寵物（犬）體內同樣可以發現高比例的HEV陽性血清，特別是在豬群中感染率尤為明顯，但HEV RNA陽性率卻遠遠低于其血清陽性率。通過對我國分離到的病毒測序比對發現，無論是人源還是動物源的HEV大多數屬于Ⅳ型。而且對我國東部及南部的分離株分析發現，豬HEV與人HEV具有較高的相似性。因此有學者推測，豬可能是HEV重要的儲存器［9］，并通過污染水源［10］和食品［11］，作為一種人獸共患病病原在豬群及人群中自由傳播。通過對我國部分地區，如我國上海、北京、湖南、廣西及內蒙古等西部省份不同豬群調查表明，不同日齡、不同養殖方式的豬群中HEV陽性血清均維持在一個較高水平，3月齡以上豬群感染率高于三月齡以下豬群［4］，散養豬群血清陽性率尤高，在北京部分散養豬群中陽性率可達90%以上［12］。因此可以推斷，我國大多數地區的大多數豬群均有過HEV的感染經歷，而且部分豬群正處于隱性感染階段。

盡管自然感染HEV豬群很少出現典型的臨床癥狀或發病，但我國不同豬群HEV高感染水平的現狀我們不能夠忽視，因為豬群具有潛在的作為HEV儲存器的能力。同時有研究表明，豬HEV可能跨種間傳播給人類，因此針對豬HEV的展開深入的研究，對于公共衛生、器官移植及動物源性食品安全有著重要的意義。

2 豬戊型肝炎診斷方法

豬HEV具有跨宿主傳播給人類的可能，對該病毒進行及時有效的診斷十分重要。目前實驗室常用的豬HEV診斷方法有PCR、ELISA、免疫組化、原位雜交及其他分子生物學和免疫學方法。

2．1 用于豬HEV檢測的PCR方法 由于豬HEV屬于單股正鏈RNA病毒，因此實驗室最早采用RT－PCR方法進行該病原的檢測，Huang等［13］針對病毒ORF2段基因設計引物擴增出大小為392 bp的產物，用于RT－PCR的檢測，該方法不但可以進行的病原的檢測，而且序列分析表明，美國豬HEV流行株與美國人HEV流行株具有高于79%的相似性。另外一種PCR方法為巢式RT－PCR（nRT－PCR），Choi等［14］最早設計兩對引物對福爾馬林固定的肝臟進行了豬HEV的檢測，試驗方法具有很好的特異性，目前該方法在很多實驗室中被廣泛應用。隨著實時定量PCR方法（Real－Time PCR）的不斷改進和完善，在豬HEV檢測技術中又相繼出現了 SYBR GreenⅠReal－Time PCR［15］和TaqMan Real－Time PCR［16］方法，這些方法不但有高于nRT－PCR的靈敏性，而且可以用于多重檢測方法的建立。為建立一種靈敏可視化PCR檢測方法，本人所在研究團隊建立了環介導等溫擴增技術（Loop－Mediated Isothemal PCR，LAMP）用于該病毒的檢測，試驗方法具有與nRT－PCR相同的靈敏性，可有效的用于臨床樣品的檢測（研究結果未發表）。

2．2 用于豬HEV檢測的ELISA方法 由于HEV病毒血癥持續的時間較短，在流行學病調查中單獨使用PCR檢測結果，會造成結果的片面性，因此常常采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）用于HEV抗體的檢測，以對PCR檢測結果進行補充。Engle等［17］將豬HEV和人HEV重組ORF2蛋白用于ELISA方法的建立，盡管二者在氨基酸序列上存在5%的差異性，但試驗結果表明，二者可同時用于豬和人HEV抗體的檢測，這表明兩種HEV在OFR2段可能存在相同的抗原決定簇。Hu等［18］通過對豬HEV ORF2基因進行序列分析，發現在其394～660bp之間集中存在病毒的構象表位，因此將其表達后包被于固相載體上，并結合應用該蛋白過氧化物酶標記產物，建立了雙抗原夾心ELISA檢測方法用于HEV抗體的檢測，該方法不但具有較強的靈敏性和特異性，而且可以用于HEV感染后14d血清的檢測。另有研究表明，應用Ⅲ型HEV桿狀病毒重組衣殼蛋白也可以有效地用于其血清的檢測［19］。

目前，國內有使用國外進口豬HEV ELISA試劑盒用于國內豬血清檢測的報道，國外ELISA試劑盒中包被抗原多為Ⅱ型或Ⅲ型HEV，與目前國內主要流行Ⅳ型HEV在基因型存在較明顯的差別。雖然國外進口豬HEV ELISA試劑盒用于國內豬血清檢測時可以檢測到陽性血清的存在，但其結果是否能夠客觀反映流行水平，還有待進一步討論。

2．3 用于豬HEV檢測的免疫組織化學和原位雜交方法 免疫組織化學法和原位雜交檢測方法可以用于檢測病原的組織分布，甚至檢測其在細胞內的定位。Chio［20］等人首先應用一段長度為289bp的地高辛標記的cDNA探針對自然感染HEV病豬的肝臟及其他組織進行了檢測，結果發現，在肝臟及膽管內可以見到陽性信號的分布，同時在小腸、大腸、脾臟、淋巴結、扁桃體及腎臟中也發現了陽性信號的分布。Ha等［21］最早應用免疫組化方法對PCR檢測為陽性，且為福爾馬林固定的自然感染病例樣品進行了HEV的檢測，檢測結果與Chio得到結果一致。二人的研究結果表明，豬HEV主要分布于肝臟的肝細胞，同時在肝外組織也可以見到少量的分布。另有研究應用原位雜交技術表明，在變性及空泡化的肝細胞內不能發現雜交信號的存在［22］，這提示我們HEV感染豬后僅能引起肝細胞發生輕微的病理變化，并使其處于亞臨床癥狀階段。

2．4 其他方法 HEV是一種基因型比較復雜的病毒，不同國家和地區的不同毒株都可能存在一定差異。對湖南豬HEV流行毒株進行序列分析結果表明，多數屬于Ⅳ型，但也存在其他基因型的可能［7］。一直以來多應用序列分析的方法進行分子流行病學分析，這種方法稍顯費時費力。針對這種情況，并結合HEV基因特點，Sun等［10］采用異源雙鏈遷移分析方法（heteroduplex mobility assays，HMA）用于區分豬HEV野毒株和參考毒株，這種方法不但適用于HEV分子流行病學的測序前調查，對于其他基因型復雜的病毒應該同樣有效。另外，在檢測方法方面，本研究團隊最近建立了免疫過氧化物酶單層細胞試驗方法（immunoperoxidase monolayer assay，IPMA），將穩定表達 HEV ORF2蛋白的細胞系包被于固相載體上，用于其抗體的檢測，該方法在實驗室應用取得了較好的效果（研究結果未發表）。

3 豬戊型肝炎病毒感染模型及感染途徑

目前無論是人HEV還是豬HEV研究面臨的最大問題是，還沒很好細胞系能夠對其進行穩定的傳代培養。但最近有研究顯示［23］，豬和人的某些細胞系能夠用于豬Ⅳ型HEV的傳代，研究結果表明，用豬肛門拭子和肝臟接種豬腎細胞系（IBRS－2）和人肺癌細胞（A549），當IBRS－2傳代至第8代、A549傳代至22代時，可以見到細胞病變的出現，該研究結果為今后HEV體外試驗的開展提供了重要信息。

體內試驗對于HEV的研究同樣重要，盡管目前獼猴可以用于HEV的研究［24］，但由于猴子飼養難度較大，大多數實驗室還無法正常采用。為尋找獼猴的替代動物，有人使用蒙古沙鼠（Mongolian gerbils）作為動物模型開展的Ⅳ型HEV的研究，試驗結果表明，該實驗動物通過腹膜內感染病毒后，病毒血癥和糞便排毒可以持續接近4周，同時在腸道和肝臟內檢測到病原的存在［25］。

深入了解HEV的傳播途徑對預防、控制病毒的傳播和擴散有著重要的意義。在實驗室中靜脈注射途徑是一種比較廣為使用的辦法，同時有人還采用肝內接種的辦法，這兩種感染途徑都可以獲得很好的感染效果。但在自然情況下HEV會以哪種途徑進行相互感染呢？有研究表明［26］，“糞－口”傳播是一種重要的方式，而通過“針頭”和扁桃體進行傳播的可能性則較小。另有試驗指出，當豬口服含有適量病毒的膽汁時，可以使部分實驗動物感染病毒，更重要的是還可以使與之直接接觸的“哨兵”動物感染［27］。以上這些信息提示我們，做好糞便清理工作和及時隔離疑似動物，對做好HEV的防控尤為重要。

4 小結

豬HEV是一種發現比較晚的病原，盡管國內外學者對其進行長期的研究，但仍留給我們較多的空白，例如主要抗原表位的分布、免疫機制與致病機制的具體途徑等。開展豬HEV研究最重要的原因是，該病原可以在多種動物之間傳播［28］，尤其是可能跨宿主感染人類，并在一些人群中出現高水平的致死率。預防該病原在人豬之間以及人與其他動物之間相互傳播的關鍵環節是控制傳染源并切斷傳播途徑。研究表明，帶毒動物可以通過糞便污染水源及水生生物，進一步傳播給人類。因此，如何加強動物糞便的管理，如何提高水質監測水平，以及如何避免食品源性動物受到病毒的污染，對今后的研究和監管都顯得格外重要。由于豬感染HEV較少發病，因此豬HEV疫苗的研究始終沒有明顯的進展，但可喜的是人HEV疫苗研究已經進入了3期臨床試驗階段，并取得了很好的效果［29］。在器官移植研究中有人嘗試使用豬的器官替代人的器官，因此豬HEV給異源器官移植同樣帶來了潛在的危險。但隨著HEV診斷技術的不斷優化、傳播途徑不斷明確以及相關疫苗的研發，我們有理由相信，HEV在不同種屬動物之間的傳播會得到有效的控制，豬HEV在公共衛生、食品安全以及器官移植等領域帶來的問題會得到合理的解決。

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