Endoglin蛋白對惡性膠質瘤內皮細胞的影響

王 丹 (遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110847)

惡性膠質瘤是老年患者中最為常見的原發性腫瘤〔1〕，其感染部位特殊且極具侵襲性，通過手術或放/化療均不能取得理想的效果，因此復發率高、生存期短〔2〕。新生血管是腫瘤增殖的基礎，也是侵襲和轉移的根基，同時膠質瘤也是血管化程度最高的腫瘤之一，因此靶向抑制膠質腫瘤血管生成是目前研究的熱點〔3〕。Endoglin蛋白是近年來發現的，在腫瘤血管內皮細胞生成過程中特異性高表達，因此成為了一個很有前景的生物靶分子〔4〕。本文通過干擾Endoglin的表達，研究其對膠質瘤內皮細胞的影響，為開拓膠質瘤血管治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 新鮮的惡性膠質瘤組織取自我校附屬醫院外科手術切除的標本，在手術室無菌環境下取材后放入預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)中浸泡并送到細胞室，分離內皮細胞進行試驗準備。

微血管內皮細胞培養基(EGM-2-MV)BulletKit試劑購自Lonza公司，胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，胰蛋白酶、谷氨酰胺、二甲基亞砜、焦炭酸二乙酯購自Sigma公司，RNAiso Reagent、RT-PCR試劑盒、DNA Marker購自 TaKaRa公司，其余試劑均為國產分析純。常用的細胞培養試劑及溶液均為實驗室自行配制。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將分離出來的內皮細胞置于EGM-2-MV培養基中適宜條件培養，待細胞長至85%時從恒溫培養箱中取出吸去培養液，加入PBS震蕩后棄去，加入胰蛋白酶消化液，在鏡下觀察，當細胞皺縮并且逐漸變圓時加入終止液停止消化，將培養基注入離心管內，1 000 r/min離心5 min，棄上清加PBS重新1 000 r/min離心5 min，棄上清后加入培養基重懸細胞，將傳代細胞置于各個新培養基中繼續培養。

1.2.2 細胞生長曲線測定方法 將上述傳代細胞制成細胞懸液，將細胞濃度稀釋至2×104/ml，設3個復孔，每個孔在開始試驗前2 h內加入10μl的膽囊收容素八肽(CCK-8)溶液，之后每孔加入100μl細胞懸液，放入培養箱中繼續培養，用酶標儀在450 nm處測量每個孔的吸光度，連續測量1 w做出生長曲線。

1.2.3 慢病毒轉染及檢測方法 將含有綠色熒光蛋白(GFP)熒光標記基因的Endoglin-shRNA慢病毒液進行擴增，將空病毒載體作為對照液，選擇生長情況良好的傳代細胞進行轉染，轉染時共分為三組:沉默組(加Endoglin-shRNA)、對照組(加對照液)、空白組(未進行病毒感染)，48 h后用倒置熒光顯微鏡觀察，估計慢性病毒感染效率并計算Endoglin基因的沉默率，將三組細胞進行消化成單細胞，利用PBS洗滌和重懸后再用流式細胞儀檢測GFP陽性細胞的比例。

1.2.4 總RNA鑒定 將細胞的胞內總RNA按常規方法提取后用超純水將RNA稀釋50倍，用紫外分光光度法測量260 nm和280 nm處的OD值，測量結果×50則為RNA實際濃度，用瓊脂糖凝膠電泳進行RNA完整性鑒別。

1.2.5 qPCR 將分離出的RNA混入實時PCR管內，按照95℃ 5 min→(95℃ 30 s→65℃ 30 s→75℃ 30 s→90℃ 30 s)×40次→65℃ 10 min循環1次，將擴增產物加入內切酶酵解。

1.2.6 Western印跡 將細胞裂解后提取細胞總蛋白，以標準FBS為對照測量蛋白質含量，按照十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠(SDS-PAGE)電泳方式在95 V下進行電泳，電泳結束后在50 V下轉膜1 h，轉移成功后用超純水洗去脫色液，將蛋白膜用Tris鹽酸緩沖液(TBS)浸潤后封閉振搖1 h，將一抗用TBST稀釋后浸潤于膜蛋白上，過夜孵育，將二抗與蛋白膜接觸常溫孵育1 h，再用TBST振搖清洗兩次，TBS清洗1次，將化學發光液均勻涂于蛋白膜上進行圖像采集分析。

1.2.7 劃痕試驗 將細胞置于24孔板內，平鋪細胞至完全融合，用小槍頭從中間劃一刀線，換液時去除擦下的細胞，使用活細胞工作站連續觀察細胞遷移過程，每隔20 min進行一次圖像采集，連續采集30 h。

1.2.8 Matrigel小管形成 在冰浴環境下溶解Matrigel，按每孔30μl加入96孔板內，于37℃孵育30 min，稀釋細胞懸液為5×104/ml后每個孔內加入100μl，置于適宜環境中培養72 h后鏡下觀察。

1.3 統計學方法 應用SPSS18.0軟件行t檢驗。

2 結果

2.1 惡性膠質瘤內皮細胞生長特征 培養基中的惡性膠質瘤內皮細胞呈單層貼壁生長，通過倒置顯微鏡觀察發現活細胞呈不規則梭形或多邊形，卵圓細胞貼壁，細胞內含有豐富的胞漿，在梭形細胞內常見多個核仁，相鄰細胞膜有融合現象。

2.2 惡性膠質瘤內皮細胞慢性病毒干擾率檢測結果 倒置熒光顯微鏡聯合流式細胞檢測結果發現沉默組感染率達到93%，感染效果理想。將三組進行qPCR擴增檢測顯示沉默組Endoglin mRNA表達較對照組和空白組明顯下調，通過Western印跡檢測也發現沉默組Endoglin蛋白下調明顯，提示慢病毒轉染后沉默效果理想。

2.3 內皮細胞對血管內皮細胞生長因子(VEGF)刺激反應檢測結果 三組細胞在常規培養下增殖無明顯變化，但用外源性VEGF刺激后沉默組增殖率明顯低于其余兩組，且沉默組的VEGF受體(VEGFR2)表達未增加，另外兩組VEGFR2表達量顯著增加(P＜0.01)，由此提示Endoglin基因可能會直接影響VEGFR2的表達。

2.4 劃痕試驗檢測結果 沉默組細胞與對照組比較細胞遷移速度明顯變慢，遷移數量也明顯減少(P＜0.05)，提示Endoglin蛋白可能會直接影響細胞遷移情況。

2.5 Matrigel小管試驗檢測結果 對照組在Matrigel培養中互相連接形成明顯的條索狀，最終形成了初步的小管樣結構，沉默組內皮細胞形成小管的能力明顯減弱，在鏡下觀察僅形成初級條索狀未能形成成形的小管結構，與對照組比較有極顯著差異(P＜0.01)，提示Endoglin基因可能和新生血管形成有直接聯系。

2.6 苯質金屬蛋白酶(MMP9)、MMP2、趨化因子苯質細胞衍生因子受體(CXCR4)變化檢測結果 通過qPCR檢測發現沉默組和對照組在MMP9、CXCR4表達方面無顯著性差異(P＞0.05)，但沉默組MMP2的表達明顯消弱，和對照組比較具有顯著性差異(P＜0.05)，同樣提示Endoglin基因可能和新生血管形成有直接聯系。

3 討論

Endoglin蛋白是180 kD同型二聚體細胞膜糖蛋白，其編碼基因Endoglin位于人染色體9q34內，共含有633個氨基酸。Endoglin蛋白有L/S兩種異構體，其主要區別在于氨基酸組成方式不同〔5〕。Endoglin蛋白是轉化生長因子(TGF-β)受體復合物的一個輔助成分，在體內主要參與調節細胞增殖、分化、遷移等與細胞形成相關的過程，在內皮細胞上的表現多體現在激活內皮細胞增殖。近年來研究發現Endoglin蛋白對血管發育有極其重要的作用，曾有研究人員敲除小鼠Endoglin基因，結果發現小鼠在受孕15 d內均死于心血管發育缺陷〔6〕。另有研究〔7〕指出在人胚胎期4～8 w時，Endoglin基因高表達造成Endoglin蛋白在內皮細胞上含量較多，而人胚胎期4～8 w內為心血管快速發育時期。本研究結果提示Endoglin基因對內皮細胞增殖作用有顯著調節性，通過MMP2含量下降也可以印證上述觀點;另外，Endoglin基因在血管形成方面起著極其重要作用，且能夠通過影響血管生成進而影響細胞遷移。

通過本次研究發現Endoglin蛋白是抗擊惡性膠質瘤的理想靶點，其對內皮細胞的影響比目前治療方案更為直接且聯系更為緊密，為后續研究奠定了分子基礎。

1 張艷春，齊 玲，嚴 海，等.TRAIL與環磷酰胺誘導LN215細胞凋亡的作用〔J〕.中國老年學雜志，2012;32(18):3943-4.

2 沈維高，王躍華，繆春明，等.羥基磷灰石納米粒子運載Stat3 shRNA對鼠膠質瘤C6細胞的促凋亡效應〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2012;13(1):53-7.

3 Gougos A，Letarte M.Identification of a human endothelial cell antigen with monoclonal antibody 44G4 produced against a pre-B leukemic cell line〔J〕.Immunology，1998;121(6):1925-33.

4 Sachdeva G，D'Costa J，Cho JE，et al.Chimeric HIV-1 and HIV-2 lentiviral vectors with added safety insurance〔J〕.JMed Virol，2007;79(2):118-26.

5 Perez-Gomez E，Eleno N，Lopez-Novoa JM，et al.Characterization of murine S-endoglin isoform and its effects on tumor development〔J〕.Oncogene，2005;24(27):4450-61.

6 Arthur HM，Ure J，Smith AJ，et al.Endoglin，an ancillary TGFbeta receptor，is required for extraembryonic angiogenesis and plays a key role in heart development〔J〕.Devel Biol，2009;217(1):42-53.

7 Qu R，Silver MM，Letarte M.Distribution of endoglin in early human development reveals high levels on endocardial cushion tissue mesenchyme during valve formation〔J〕.Cell Tiss Res，1998;292(2):333-43.