抗菌藥耐藥性預測框架的構成要素

郝海紅，黃玲利，王玉蓮，戴夢紅，程古月，劉振利，袁宗輝

(國家獸藥殘留基準實驗室(華中農業大學)/農業部食品獸藥殘留檢測重點實驗室，武漢 430070)

抗菌藥在有效治療病原菌感染的同時，會導致細菌產生特定的耐藥性，在特定條件下，耐藥菌優勝劣汰，適應性較強的耐藥菌得以生長繁殖并在宿主和環境中傳播流行。在這個過程中抗菌藥的使用是源頭，不同抗菌藥將導致不同的耐藥性后果;細菌耐藥性產生和傳播機制是基礎，不同耐藥機制會對耐藥菌的存在和傳播造成不同的影響;宿主和環境是影響耐藥菌傳播和流行的重要因素，不同宿主和環境將決定耐藥菌流行的規模和趨勢［1］。因此，把握“抗菌藥－耐藥菌－產生－適應－傳播－流行”過程中的關鍵因素，便有望對抗菌藥耐藥性進行預測，為新藥上市前的安全性評價提供依據，為細菌耐藥性風險評估和抗菌藥耐藥性監管措施的制定提供參考，最終為公共衛生健康服務［2］。本文從抗菌藥的作用、細菌耐藥性的產生、耐藥菌的適應性、耐藥性的轉移、耐藥性的分子流行性監測等關鍵環節，分別論述抗菌藥耐藥性預測的構成要素，從分子機理層面為構建抗菌藥耐藥性預測模型奠定基礎。

1 抗菌藥的作用

抗菌藥作用是細菌耐藥性產生的第一步，其中藥物作用機制、藥物濃度、作用時間等是影響其耐藥性選擇作用的關鍵因素。

科學界長期致力于藥物的作用機制研究，探尋藥物的結構和藥物作用靶位。根據藥物的作用靶位不同，將藥物分成:(1)抑制G+菌細胞壁合成的藥物，如青霉素類、頭孢菌素、桿菌肽等;(2)增加細菌胞漿膜通透性的藥物，如多肽類、多烯類;(3)抑制細菌蛋白質合成的藥物，如氨基糖苷類、四環素類、氯霉素類(30S)、大環內酯類和林可胺類(50S);(4)抑制細菌核酸DNA的合成的藥物，如喹諾酮類;(5)影響葉酸合成的藥物，如磺胺類、抗菌增效劑。藥物的結構與作用機制的特異性與細菌耐藥性產生密不可分。因此抗菌藥的結構和作用機制的特異性必然成為細菌耐藥性預測的重要參數。

然而Nature和Science刊發的最新研究結果顯示抗菌藥對細菌的殺滅機制具有一定的共性，即抗生素與細菌靶位(包括DNA、蛋白和細胞壁等靶位)結合以后，細菌會先通過代謝負反饋過程激活電子轉運鏈，產生超氧自由基，再通過鐵硫蛋白作用產生羥自由基，自由基破壞細菌的脂質、DNA或蛋白質導致細菌死亡［3］。在這個自由基依賴的細菌氧化損傷死亡通路(radical based oxidative damage cell death pathway)中，抗菌藥作用下細菌活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的產生似乎是決定細菌死亡或產生耐藥得以生存的關鍵因素。因此，在抗菌藥作用下，ROS的產生便也可以考慮作為耐藥性預測的重要參數。

傳統的新型抗菌藥耐藥性預測大多是基于藥物系列誘導實驗而進行的，即用一系列不同濃度的藥物對細菌進行誘導，在不同時間分析耐藥菌的產生，確定抗菌藥與細菌耐藥性產生的量效和時效關系。細菌存在一個耐藥突變選擇窗(mutant selection window，MSW)，即細菌易發生耐藥突變對應的抗菌藥濃度范圍。近年來的研究發現藥物的藥代動力學(pharmacokinetics，PK)和藥效學(pharmacodynamics，PD)參數(AUC/MIC)與這種耐藥突變選擇之間是一種不規則的倒“U”型關系，在較低的AUC/MIC藥物暴露下，耐藥突變株大量產生并穩定保持，AUC/MIC足夠大時，耐藥菌的產生才能被充分遏制。與傳統的體外誘導實驗相比，藥代動力學和藥效學同步模型綜合了PK與PD參數，并將兩個動力學過程按時間同步進行，可更真實反映藥物給藥劑量對應的時間一效應過程，預測特定抗菌藥用藥方案可能導致細菌耐藥性產生的風險［4］。

2 耐藥性的產生

在宏觀細菌領域中，細菌本身存在形形色色的潛在耐藥突變或耐藥基因，這些潛在的因子在一定的藥物選擇和環境作用下才凸顯出耐藥性。目前已經發現的細菌耐藥性的機制大致包括:(1)細菌產生滅活酶或鈍化酶以破壞抗生素的分子結構并使其失效，如β－內酰胺酶、氨基糖苷類鈍化酶、氯霉素乙酰轉移酶等。(2)靶位修飾或改變。如氟喹諾酮類藥物耐藥相關的拓撲異構酶基因gyrA和parC的突變，或者細菌產生甲基化酶、甲基轉移酶等修飾或取代靶位。(3)膜通透性和外排能力改變。細菌通過改變外膜蛋白結構或調控外排泵表達水平來阻礙抗生素的滲透和泵出［5］。但是這些耐藥性產生機制遠不足以解釋和預測細菌耐藥性。許多潛在的耐藥突變和耐藥因子尚待發掘。

在細菌群體生態環境中，細菌可能通過多種機制來產生耐藥性。最新研究發現:(1)在抗生素壓力下，細菌群體通過代謝物分享來保證群體耐藥。在液態的群體培養環境中，含有突變的高水平耐藥菌可以分泌Indole(L－tryptophan的分解代謝物)到培養基中，以便于低水平耐藥菌共享，保持群體的耐藥性。在固體培養基中，某些細菌克隆還可能散發氣態胺(gaseous ammonia，L－aspartate分解產物)，增加細菌的多聚胺濃度，調節細菌膜通透性、減低藥物對細菌的氧化應激。(2)在抗生素壓力下，細菌群體還可能通過亞生存途徑(subsistence pathways)，進入休眠狀態，產生對藥物的耐受性(tolerance)［6－7］。在營養缺乏情況下，細菌通過饑餓信號反應(starvation－signaling stringent response，SR)減緩生長或形成生物被膜，從而介導細菌對抗生素的耐受性;滅活此保護機制則可以從不同層面敏化細菌生物被膜對不同類藥物的反應，提高抗生素作用效果［8］。體內外實驗證明，添加特定代謝物(fructose，mannitol或glucose)到細菌外環境中，可以為細菌提供質子原動力(proton－motive force)激活耐受菌的核心物質代謝和呼吸、激發細菌對代謝物或藥物的吸收、提高藥物對細菌的敏感性。(3)在抗生素壓力下，細菌在一個復雜的微生態環境中，通過其他多種機制實現生存，比如土壤細菌可以把抗生素作為主要碳源吞食，將抗生素從環境中清除;有些細菌可以利用環境中的一些天然小分子(如microfluidic)獲得耐藥性;有些細菌可以感知環境中抗生素濃度梯度，逃避到相對低濃度區域進行快速繁殖和生存而獲得耐藥性。

鑒于大多數抗生素生產微生物本身對多種抗生素耐藥，現代研究提出用“耐藥組學(resistome)”的概念來涵蓋所有環境中存在的抗菌藥耐藥基因，即在環境中天然存在許多潛在的耐藥因子［9－11］。利用現代宏基因組學、生物信息學以及轉座子突變體庫構建等手段盡可能多地發掘病原生態環境中潛在的耐藥突變、耐藥因子、耐藥性產生信號機制等，則可以幫助人們把握細菌耐藥性產生的潛在性，預測抗菌藥耐藥性可能的發生方向。

3 耐藥菌的適應性

細菌在獲取耐藥性同時，其自身的生理特性(毒力和適應性等)也隨之改變。適應性是指耐藥菌在沒有藥物選擇壓力的情況下，對不同環境的適應能力，包括生長力，定植力，侵襲力、致病力等，主要是相對敏感菌的競爭力。耐藥菌的相對適應性(relative fitness)是決定耐藥菌在宿主或環境中存在、擴散、轉移和流行的生命基礎。不同細菌，不同耐藥類型，不同環境，這種適應性變化也有差異。有些耐藥細菌表現適應性代價(fitness－cost);有些則表現出適應性增強(enhanced fitness)，如氟喹諾酮耐藥彎曲桿菌［12］;某些具有適應性代價的耐藥菌，在長期的進化過程中，可能會產生相應的代償性變化(compensatory mutation)來緩解其適應性代價，增強其自身競爭力［13］。

耐藥菌的適應性是相對的、有條件的，受到耐藥產生類型、耐藥菌自身進化機制和耐藥菌所處環境等的影響。Gagneux等［14］在Science上的一篇關于《結核分支桿菌多重耐藥性與競爭生長力》文章中對不同基因背景、不同的耐藥突變點的耐藥菌進行競爭生長力測定，發現耐藥菌的競爭生長力受細菌的基因背景和所產生的突變點的雙重影響。他們同時還將實驗所獲得的競爭生長力的數據同臨床耐藥菌分子流行病學調查結果進行比對，發現相對適應性的高低與臨床分子流行情況的頻繁程度呈正相關。耐藥菌的適應性并不是一成不變的，引起適應性代價的細菌，在長期不接觸藥物的情況下，通過其自身的進化機制，還可能產生其他方式的突變(compensatorymutations)以補償這種適應性代價，從而使細菌不僅可以保持其耐藥性，而且恢復其適應性和生長力［15－18］。但是，這種適應性補償性進化突變的產生受到環境的極大影響，不同的環境，其補償性突變也不同。Bjorkman等［19］在Science一篇文章《環境對于補償性突變的影響》中報道同一株耐藥沙門氏菌在LB肉湯和在小鼠體內進化產生的補償性突變是不同的，并且他們還發現體外適應性測定方法結果，即通過體外競爭生長力試驗所測定的相對適應性(relative fitness)數值與體內所測定的相對適應性的結果存在差異，故對耐藥菌和耐藥補償菌的相對適應性測定需要綜合體外和體內相對適應性的結果進行綜合分析。

細菌的適應性可以在培養基或動物模型中通過相關試驗進行測定［12，15，20］，并在測定過程中考慮諸多可變因素，比如耐藥突變類型、適應性補償變化和環境等因素，建立相應的數學模型，預測特定的耐藥菌未來的流行趨勢。

4 耐藥性的轉移

耐藥菌可能通過垂直克隆進行傳播和轉移。比如從農場、養殖人員與養殖動物體分離的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)具有相同的分子分型，提示這些MRSA超級細菌可能通過直接的接觸傳播，從動物(豬、牛和其他寵物等)傳染給人［21－23］。

許多耐藥因子都可通過可移動元件(mobile genetic elements，MGEs)進行傳播和轉移。這些MGE包括插入序列、噬菌體、質粒、轉座子、基因島、毒力島和染色體盒等。臨床中分離的G+菌，如腸球菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌等都表現出多重耐藥性，因為他們可以從可移動元件上獲取外源耐藥基因，通過不斷整合外源耐藥基因而獲得多重耐藥性［24］?？剐曰蚩赏ㄟ^水平轉移(Lateral Gene Transfer，LGT)在細菌間共享，使得耐藥性因子可以跨越菌屬的界限，在畜禽、環境和人類之間廣泛傳播［25］。近年來的報道顯示，人腸道微生態中的一些不可培養細菌可能是耐藥基因的儲存庫，但其貯存的耐藥因子是否可以轉移給病原菌取決于供體和受體的進化距離［26］。有報道指出，在環境和人腸道微生態中，MGE是耐藥基因的載體，具有一定的生態風險［27］。MGE的宿主范圍越廣，其推動耐藥因子轉移的風險就越大，但是MGE的分布往往具有一定的特異性，特定細菌往往獨擁特定的MGE，并且在一定的“基因交換細菌團體(genetic exchange bacterial commmities)”中，MGE會嚴格控制攝入的基因成分以保持其代謝或共耐藥性［28－29］。因此，細菌的“耐藥組”是否可能被 MGE捕獲，決定了特定耐藥基因的傳播風險。然而，目前MGE相關的風險預測幾乎未見報道，畢竟當前預測細菌“耐藥組”被MGE捕獲的可能性的方法，特別是定量的風險評估方法還尚待研究。目前，僅可以通過實驗測定特定耐藥基因所定位的基因交換團體的大小和結構對MGE的捕獲能力和耐藥基因的獲取風險進行預測［30］。

5 耐藥性的流行監測

從細菌的耐藥發展史看，耐藥菌出現最多只需2年時間。比如1960年，甲氧西林被開發用于臨床，1961年耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)被發現，并迅速傳播，到20世紀90年代，多重耐藥高毒力的耐甲氧西林的金葡菌廣泛流行，目前幾乎無藥可醫。在碳青霉烯類藥物被開發用于臨床后，2010年8月11日Lancet Infect Dis刊發了產Ⅰ型新德里金屬β－內酰胺酶(new delhimetallo－lactamase 1，NDM－1)泛耐藥腸桿科細菌，簡稱NDM－1細菌，此“超級細菌”對除替加環素和黏菌素外的藥物幾乎“刀槍不如”［31］。隨后NDM－1菌也在醫院外的社區人群中被分離到［32］。并且農牧業中抗菌藥的使用很可能導致動物耐藥菌增加，這些動物源耐藥菌也很可能通過食物鏈途徑傳播，繼而導致人感染耐藥菌比例增加，比如氟喹諾酮耐藥彎曲桿菌。美國農業部和動物衛生部在批準家禽使用氟喹諾酮類藥物后3年內，美國國內醫院發現人類感染耐氟喹諾酮類彎曲桿菌腸道疾病增加、患者病程加長和病情復雜，使用氟喹諾酮類藥效下降或者無效［33］。1976－1980年間，糖肽類藥物阿伏帕星在歐洲作為促生長劑被廣泛用于食品動物，后來發現阿伏帕星在食品動物的使用可能導致萬古霉素耐藥腸球菌的產生和流行，因此1998年該藥被歐洲國家禁止用于食品動物。

藥物在投入使用后，環境中眾多因素可能導致其耐藥性流行。在臨床的復雜環境中，特別是要準確、長期和全球性預測抗菌藥耐藥性產生、耐藥基因捕獲、新耐藥基因建立、耐藥基因在細菌群體中的傳播和進化，是非常困難的，因為其中的變量太多，復雜性難以掌控。在目前的技術和科學水平上，只能在藥物應用初期對潛在的耐藥成分進行分子流行性調查，并在期間考慮細菌群體環境和抗菌藥的尊者作用等，應用高通量的宏基因組學方法篩選藥物作用下細菌群體可能產生的耐藥突變、獲取的耐藥基因以及MGE流行情況，以此提供可以固定的耐藥性預測線索［34－35］。多角度的分子流行病學調查策略可以全面分析耐藥基因以及耐藥基因的交換和整合風險，為抗菌藥耐藥性預測模型和定量風險評估方法的建立奠定基礎。

6 展望

抗菌藥的耐藥性預測框架涵蓋內容廣，工程復雜，需要在全面探索抗菌藥作用機制和細菌耐藥性產生適應和傳播機制的基礎上，應用現代組學和系統生物學思路，挖掘細菌潛在的“耐藥組”，預測藥物作用下細菌耐藥性產生可能性，評價特定耐藥性對應的適應性和代償性變化，多方位測定特定耐藥基因被可移動成分的捕獲能力，評定特定耐藥基因在環境中的轉移和擴散風險。此外，在耐藥性預測框架中，除耐藥菌適應性評定方法已相對成熟外，其他很多預測內容尚沒有標準化的定量方法可參考，并且環境中復雜的因素更增加了抗菌藥耐藥性預測的難度。目前，抗菌藥耐藥性預測已經成為歐盟框架項目中的重點項目，我國雖然在耐藥性預測框架的各個環節已經逐步開展了相應的研究和監測工作，但是缺乏總體規劃和系統研究?？咕幠退幮灶A測道路漫長，任重而道遠。

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