中藥多糖抗神經細胞缺血/缺氧性凋亡研究進展

向 勤， 胡國柱

（1.南昌大學醫學院，江西南昌330006；2.江西省人民醫院臨床醫學研究所，江西南昌 330006）

中藥多糖抗神經細胞缺血/缺氧性凋亡研究進展

向 勤1， 胡國柱2

（1.南昌大學醫學院，江西南昌330006；2.江西省人民醫院臨床醫學研究所，江西南昌 330006）

神經細胞缺血/缺氧性損傷是誘發多種神經系統性疾病發病的因素之一。多糖是中藥有效成分之一，具有抗氧化和抗凋亡等生物活性。本文就缺血/缺氧與神經細胞凋亡的關系及中藥多糖抗神經細胞缺血/缺氧性凋亡機制的研究現狀做一綜述。

中藥多糖；缺血；缺氧；神經細胞；細胞凋亡

細胞凋亡 （apoptosois）是細胞由基因控制的自主有序的細胞死亡，而腦組織缺血/缺氧易導致神經細胞凋亡［1］。中醫理論認為細胞作為構成生命體結構和功能的基本單位包含兩方面的屬性，即細胞增殖屬陽，細胞凋亡屬陰，增殖與凋亡的平衡是陰陽在細胞水平反應。一旦增殖與凋亡平衡紊亂則出現陰陽的偏盛偏衰的病證。機體細胞異常增殖為陽盛，而凋亡減退為陰微；細胞增殖減退為陽微，而凋亡過盛為陰盛，這是中醫對腫瘤形成及自身免疫性疾病發生的病理生理學認識，這些變化與多種免疫缺陷病和退行性病變有關。誘導細胞凋亡的中藥現已發現絕大多數用于抗癌，如小柴胡湯其黃芩苷元可引起典型細胞凋亡。而許多補益類中藥能抑制細胞凋亡，如枸杞多糖能抑制地塞米松誘導的小鼠胸腺細胞凋亡，六味地黃湯能抑制糖皮質激素誘導的胸腺淋巴細胞凋亡。成人繼發T細胞免疫缺陷癥用六味地黃湯 （丸）進行滋陰補腎［2-3］。中醫學認為腎藏精，生髓通腦，故腦發育由腎所主。腎虛可導致腦發育障礙，應用恐傷方法制作孕鼠腎精虧虛模型，經熟地黃、枸杞子、制首烏、淫羊藿等組成的中藥補腎填精方煎劑灌胃治療恐傷孕鼠，結果模型組仔鼠海馬區腦組織Bcl-2陽性表達數下降、Bax陽性表達數升高，而補腎組則Bcl-2陽性表達數上升、Bax陽性表達數顯著下降 （P＜0.01）、仔鼠海馬區腦組織細胞凋亡率也顯著下降 （P＜0.05）［4］。中藥多糖作為中藥藥效成分之一，參與了機體的各種生命活動，其中包括抗氧化、抗細胞凋亡、抗衰老等，且毒副作用小，應用前景非常廣闊。本文就中藥多糖成分抗缺血/缺氧引起的神經細胞凋亡的作用及機制做一綜述。

1 細胞凋亡的生物學特征

細胞凋亡時胞體縮小，胞膜有小泡狀形成，膜內側磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面，細胞質密度增加，線粒體膜電位消失，通透性增大，細胞色素C釋放到胞漿，核質濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解成為約180～200 bp片段或其整數倍［5-6］。細胞在凋亡的整個過程中質膜完整，細胞內含物不外泄，不會發炎癥反應。

2 腦缺血/缺氧與神經細胞凋亡及凋亡途徑

腦血管痙攣、腦栓塞、甚至腦出血均能引起腦缺血/缺氧，導致神經細胞凋亡。目前缺血/缺氧或再灌注誘導神經細胞凋亡機制還不是很清楚，但興奮性氨基酸釋放增加，如谷氨酸、天門冬氨酸［7-8］；細胞內自由基大量產生，如羥自由基、超氧陰離子［9］；細胞內離子平衡被打破，如胞漿Ca2+增加［10］、Na+/K+-ATP酶活性下降所致的胞內外Na+/K+平衡紊亂［11］；線粒體損傷，如膜通透性的改變導致細胞色素C、凋亡誘導因子等多種活性物質泄入胞漿等［12］；凋亡相關基因表達失衡，如Bcl/Bax比值下降等均可能在凋亡過程中發生重要作用。并最終通過三條主要途徑介導細胞凋亡：①外源性途徑：死亡受體如Fas、TNFR等在配體FasL、TNF-α刺激下，通過接頭蛋白 FADD將Caspase-8酶原招募到細胞質膜上，形成死亡誘導信號復合物DISC。Caspase-8酶原在這個復合物中被活化，進而激活下游的Caspase蛋白家族并引發級聯反應，誘導細胞凋亡［13-14］。②內源性途徑：生長因子、激素、細胞因子，以及自由基、缺氧、病毒感染等非受體介導的凋亡刺激，引起BH3-only蛋白家族 （BAD、BIK、BID等）活化，導致線粒體外膜通透性轉換孔開放、膜電位下降，促使線粒體向細胞質內釋放細胞色素C、絲氨酸蛋白酶Omi以及其它凋亡誘導因子，釋放的細胞色素C與Apaf-1和Caspase-9前體形成凋亡復合物，并活化Caspase-9。活化的Caspase-9激活下游的Caspase級聯反應，或者線粒體釋放的另外的凋亡因子EndoG，AIF［15-16］等，直接進入細胞核，引發DNA斷裂，引發細胞凋亡。③穿孔素-顆粒酶B途徑：顆粒酶B進入細胞后直接裂解天門冬氨酸殘基活化Caspases蛋白［17］，促進Caspase級聯反應，引發細胞凋亡。由此可見，細胞凋亡是多通路、多環節、多層次和高度復雜的可控過程，并且每一條途徑并不是孤立存在，而是相互交錯，聯系在一起的。而中藥多糖具有多靶點、多途徑等中藥作用的典型特點，可以同時活化幾條抗凋亡通路，體現出抗凋亡作用的多樣性。

3 中藥多糖抗神經細胞缺血/缺氧性凋亡作用及機制

不同種類的中藥多糖由于構成其多糖的單糖種類和比例的不同，其分子量、空間結構、溶解度，以及生物活性也不盡相同，并體現藥理作用的多樣性。中藥多糖成分不僅有抗輻射、抗炎癥、抗病毒［18］、抗凝血、抗腫瘤［19］、降血脂和血糖［20］，提高機體免疫還具有抗氧化和衰老，抗神經細胞缺血/缺氧性損傷作用。

3.1 抗自由基損傷 自由基是細胞代謝過程中產生的具有氧化活性的物質，它能使細胞內的生物大分子和細胞膜中的脂質超氧化，引起細胞結構和功能的損壞。細胞內的自由基主要包括活性氧基團 （ROS）和活性氮基團 （RNS），如羥自由基與帕金森病 （Parkinson's disease）密切相關［21］。中藥多糖對自由基有很強地清除作用，刁波等［22］發現質量終質量濃度為2.5～10 mg/mL的刺五加多糖能夠有效地降低H2O2刺激的海馬神經元丙二醛 （MDA）、ROS的水平并對海馬神經元氧化損傷有保護作用。魏炳棟等［23］研究發現黃芪多糖、枸杞多糖和人參莖葉多糖均能有效地清除細胞內的羥自由基，并且復合多糖較單一多糖具有更強的清除力，從而保護了細胞生物膜系統的穩定性，抑制細胞凋亡。馬慶華等［24］研究發現0.056 mg/mL白術多糖能夠使衰老大鼠大腦皮質超氧化物歧化酶 （SOD），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力增強，MDA水平降低，并有效地抑制DNA的損傷。由此可見，中藥多糖可以通過提高細胞SOD，谷胱甘肽 （GSH）的活性達到清除胞內氧化自由基的目的，抑制氧自由基對線粒體膜和mtDNA的損傷，提高細胞對mtDNA的修復能力，抑制細胞凋亡［25］。

3.2 作用于細胞內的信使 神經細胞缺血/缺氧性損傷極易造成細胞外Ca2+的內流和線粒體內Ca2+的釋放，而游離的Ca2+可調節蛋白激酶C（PKC）、酪氨酸蛋白激酶偶聯的受體及cAMP或cGMP、核酸內切酶和磷酸水解酶的活性，引起細胞膜結構的破壞、興奮性遞質和氨基酸的增加、DNA的損傷等，中藥多糖對由這種途徑造成的細胞損傷有一定的抑制作用。汪茜等［26］參照改良的Longa線栓法建立大腦中動脈栓塞模型大鼠，在研究黃芪多糖對缺血缺氧腦損傷大鼠腦組織Ca2+和興奮氨基酸的影響時發現，黃芪多糖能夠明顯降低缺血缺氧損傷大腦組織中總Ca2+水平，緩解缺血/缺氧對神經細胞造成的進一步損傷。體外培養的神經細胞研究表明［27］，當去除神經營養因子后提高胞內cAMP水平有明顯抑制細胞凋亡的作用。但也有研究表明細胞內cAMP水平的增加也可以誘導細胞凋亡［28］。梁霜等［29］研究發現低劑量的玉郎傘多糖能夠提高大鼠大腦中cAMP的水平，而高劑量的玉郎傘多糖可以抑制cAMP的活性。一氧化氮 （NO）作為一種重要的氣體信號分子主要由神經元和血管內皮細胞分泌，對維持海馬細胞的認知能力具有重要的作用，而神經一氧化氮合成酶 （nNOS）對大腦NO的合成起著決定性的作用，而NOS活性的增加引起線粒體能量障礙，線粒體中的細胞色素C水平增加并釋放到胞漿中，引起細胞凋亡［30］。研究表明刺五加多糖能夠明顯減低氧化損傷的海馬神經元中NO的水平，其可能的機制是抑制了神經元中誘導型一氧化氮合酶 （iNOS）mRNA的表達［31］。

3.3 調節凋亡相關基因的表達 在線粒體介導的細胞凋亡途徑中Bcl-2蛋白家族起著重要的調控作用，而Bcl-2蛋白家族成員根據其功能分為Bcl-2，Bcl-x，Bcl-w等凋亡抑制分子和Bax，Bak，Bad，Bid等凋亡促進分子。當細胞受到內部的 （如DNA損傷）或者外部的 （如藥物、自由基）刺激時，細胞將凋亡信號傳遞給線粒體后，引起線粒體膜通透性的改變，線粒體釋放大量的凋亡誘導因子 （如細胞色素C）到細胞質中，促進細胞發生凋亡。而在抗凋亡的信號通路中核轉錄因子-КB（NF-КB）處于中心位置，大腦內神經細胞因子通過絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT活化NFКB，進而轉錄激活凋亡抑制因子，從而抑制細胞凋亡［32］。另一方面在促進細胞凋亡的信號中，轉錄因子p53可以通過上調Bax的表達水平，以及下調Bcl-2的表達或通過死亡信號受體蛋白途徑誘導細胞凋亡的發生［33］。研究表明黃芪多糖經原位末端標記法 （TUNEL）具有抗缺氧/缺血誘導的大腦海馬區神經細胞凋亡的作用，免疫組化發現黃芪多糖可以抑制腦出血后核因子NF-КB的高表達，加速缺損的神經功能恢復［34-35］。應用免疫細胞化學，Hoechst33342熒光染色，DNA電泳以及AnnexinV/PI雙染流式細胞儀測定等方法研究黃精多糖抗神經細胞缺血/缺氧性凋亡時發現，0.5～1.5 mg/mL的黃精多糖具有明顯的抗神經細胞缺血/缺氧性凋亡作用，并隨著質量濃度的增加抗凋亡作用增強。進一步研究發現缺氧前加入黃精多糖可以上調神經細胞內Bcl-2蛋白的表達，下調Bax蛋白的表達。由此可推測黃精多糖可能通過調節凋亡基因的表達，來調節Bcl-2/Bax比值來實現抗細胞凋亡作用的［36-37］。蘆薈多糖抗腦缺血大鼠模型研究表明，蘆薈多糖給藥組與陽性組和模型組比較細胞凋亡蛋白caspase-3表達量顯著下降 （P＜0.01），p53蛋白的表達量較模型組也顯著降低，說明蘆薈多糖可以通過抑制caspase-3蛋白、p53蛋白的表達抑制細胞凋亡［38-39］。

3.4 對神經遞質的影響 腦內神經遞質中的兒茶酚胺、乙酰膽堿 （Ach）、γ-氨基丁酸 （GABA）、谷氨酸、組胺和小肽類等均對腦功能具有維持作用［40］。腦缺血/缺氧容易導致γ-氨基丁酸釋放減少 谷氨酸釋放增加，腦內神經遞質代謝紊亂［41］，而釋放的谷氨酸可以通過線粒體途徑介導細胞凋亡［42］。楊娟等［43］運用神經干細胞谷氨酸損傷模型模擬腦梗死中神經元缺血缺氧性損傷時發現，高濃度的刺梨多糖對神經干細胞谷氨酸損傷具有保護作用，推測其可能是抑制谷氨酸鈉所引起的Ca2+升高。張振東等［44］采用反復缺血/再灌注法造模，研究土黨參多糖對小鼠腦缺血/再灌注損傷的保護作用時發現，土黨參多糖能夠明顯降低小鼠海馬區神經元損傷，并且中劑量的土黨參多糖能夠明顯抑制Ach水平的下降，高劑量的土黨參多糖能夠明顯降低乙酰膽堿酯酶 （AchE）的活性。由此可見，中藥多糖可以通過調節腦內神經遞質代謝平衡而達到保護腦損傷的目的。

3.5 作用于熱休克蛋白 腦缺血/缺氧或再灌注神經細胞損傷后引起細胞的應激反應，產生熱休克蛋白抑制應激誘導的c-Jun N-terminal激酶 （JNKs）的激活，從而減少細胞凋亡［45］。有研究表明，缺血/缺氧再灌注1 h后熱休克蛋白70有高表達，而熱休克蛋白70合成的增加能減輕細胞的凋亡，并阻止細胞啟動自殺途徑［46-47］。王志鵬等［48］運用免疫組化和western-blot方法研究大黃多糖對腦損傷后大鼠腦皮層熱休克蛋白70表達，結果發現大黃多糖可以促進熱休克蛋白70的表達，啟動內源性的保護機制保護受損的腦組織，加快腦損傷的康復。可見中藥多糖可以促進熱休克蛋白70的表達，抑制細胞發生凋亡。

4 展望

雖然已經發現部分中藥多糖成分有一定的抗缺血/缺氧或再灌注誘導的神經細胞凋亡的作用，但仍缺乏不同藥性的中藥其多糖抗缺血/缺氧或再灌注誘導的神經細胞凋亡作用系統性研究，以及抑制細胞凋亡的機制系統研究。因此，進一步深入對不同藥性的中藥其多糖進行抗缺血/缺氧性神經細胞凋亡的系統性研究十分必要，其將有助于中藥的開發應用，以及疾病治療的新組方的創立和應用，為中醫藥的現代化提供基礎。

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R285.5

A

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10.3969/j.issn.1001-1528.2013.04.043

2012-04-17

向 勤 （1985—），男，碩士生，研究方向：神經修復與再生。Tel：13787093757，E-mail：xqlcjy@163.com

*通信作者：胡國柱 （1956—），男，研究員，研究方向：神經修復與再生。E-mail：hgz56@126.com