急性淋巴細胞白血病中Bcl-2的表達與早期化療效果的關(guān)系分析

杜春輝徐 麗

（1 新疆喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院 新疆 喀什 844000；2 廣州中山大學(xué)血液學(xué)研究所 廣東 廣州510630）

急性淋巴細胞白血病中Bcl-2的表達與早期化療效果的關(guān)系分析

杜春輝1徐 麗1

（1 新疆喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院 新疆 喀什 844000；2 廣州中山大學(xué)血液學(xué)研究所 廣東 廣州510630）

急性淋巴細胞白血?。籅cl-2表達；化療；效果

急性淋巴細胞白血病（acute lymphocyte leukemia ，ALL）屬造血干細胞異常增生的惡性腫瘤疾病，其發(fā)病機制目前尚不清楚[1]。一般認為凋亡基因參與許多惡性腫瘤細胞的增殖調(diào)控[2]。Bcl-2是主要的抗凋亡基因，存在于人體多種細胞中，如未成熟的造血細胞、神經(jīng)細胞、上皮細胞及多種癌株中，其編碼的Bcl-2蛋白主要位于細胞的核膜、線粒體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上[3]。Reed的研究表明，Bcl-2的表達狀態(tài)可決定細胞的生存和死亡，其編碼的Bcl-2蛋白能有效阻止多因素介導(dǎo)的細胞凋亡[4]。多種腫瘤如淋巴瘤、神經(jīng)母細胞瘤、乳腺癌中Bcl-2基因均有高表達，表明腫瘤的發(fā)生與Bcl-2基因的異常表達有一定關(guān)系。本研究采集32例急性淋巴細胞白血病患者的骨髓，檢測bcl-2表達水平，并分析其與疾病早期化療效果的相關(guān)性，以探討該凋亡基因表達與急性淋巴細胞白血病臨床治療的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2011年10月至2012年10月新疆喀什地區(qū)人民醫(yī)院血液科32例ALL患者，男22例，女10例；年齡9～78歲，平均59歲，符合FAB診斷標準。FAB分型：L121例，L28例，L33例。對照組選擇自愿受試的骨髓象正常的非白血病患者標本15例，近期均未應(yīng)用過糖皮質(zhì)激素及其它免疫抑制劑，其中男8例，女7例，年齡14～72歲，平均60歲。兩組對象構(gòu)成比無顯著性差異。

1.2 分組原則

治療前按照危險因素評定標準將所有入選病例分為不同等級，其中高危組4例，中危組7例，低危組21例。危險因素包括年齡、免疫分型、染色體核型、白細胞計數(shù)、髓外浸潤、分子生物學(xué)改變。治療上采用標準化療方案，ALL的誘導(dǎo)緩解方案為DVLP或CODP（D：柔紅霉素、V/O：長春新堿、L-Asp：左旋門冬酰胺酶、P：強的松、C：環(huán)磷酰胺）。所有病例的治療反應(yīng)都依據(jù)d8潑尼松試驗（即潑尼松60mg/m2連用7d，聯(lián)合鞘內(nèi)注射1次）和/或d19骨髓檢測來確定。

1.3 實驗方法

在化療前及d19所有入選病例均抽取2mL骨髓，使用Ficoll單核細胞分離液進行分離涂片，使用乙醇乙醚固定液進行固定，并用錫紙封存于4℃冰箱內(nèi)備用。染色采用S-P免疫組化法，SP通用試劑盒（SP9000）及單克隆抗體Bcl-2均購自北京中山生物技術(shù)有限公司，系美國ZYMED公司生產(chǎn)。使用正常羊血清進行封閉，滴加一抗后在4℃濕盒內(nèi)過夜（Bcl-21：100），繼而滴加二抗（羊抗鼠IgG抗體1∶200），1h后滴加鏈酶卵白素在37℃下孵育，鏈酶卵白素使用1∶300稀釋的辣根過氧化酶標記。每一步驟后均以PBS緩沖液沖洗，鏡下控制DAB顯色，然后以流水沖洗，沖洗后使用蘇木素復(fù)染。結(jié)果判定：陽性細胞為細胞質(zhì)和（或）細胞核著色呈棕褐色或棕黃色者，并計算1000個細胞中的陽性細胞數(shù)及陽性細胞表達率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS軟件進行相關(guān)分析、t檢驗及F檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Bcl-2表達水平與初治ALL臨床相關(guān)危險因素的關(guān)系與對照組相比，ALL組Bcl-2蛋白的表達水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=312558，P＜0101）；不同危險分層的患者，治療前后組間比較采用F檢驗，F(xiàn)分別為314317、411132，三組均有顯著性差別P＜（0.05），見表1。

2.2 Bcl-2表達水平在兒童ALL緩解前后不同的早期治療反應(yīng)的比較32例患者，早期治療反應(yīng)好者23例，早期治療反應(yīng)差者9例。兒童ALL緩解前后早期治療反應(yīng)好組較反應(yīng)差組均有顯著性差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01、0.05）；結(jié)果表明，早期治療反應(yīng)好者，緩解后Bcl-2蛋白表達水平明顯降低治療期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=117309；P＜0.05），反應(yīng)差者Bcl-2蛋白表達水平較治療前降低，但無顯著性差異（t=111875；P＞0.05），不過其Bcl-2蛋白表達水平仍顯著高于對照組（t=214164；P＜0.05），見表2。

3 討 論

Bcl-2是主要的抗凋亡基因，位于18號染色體長臂2區(qū)1帶（18q21），由230kb組成。共編碼2種蛋白質(zhì)，即p26-bcl-2A和p22-bcl-2B，目前研究較多的是p26-bcl-2A。Bcl-2家族成員至少有一個名為Bcl-2同源（BH）區(qū)域的保守結(jié)構(gòu)。基于BH區(qū)域的功能和數(shù)量，Bcl-2家族被分為三個亞組，他們都是重要的凋亡調(diào)節(jié)蛋白?？沟蛲龅募易宄蓡T包括Bcl-2和Bcl-XL，含BH1-4。研究發(fā)現(xiàn)，多種惡性腫瘤如胃腸道腫瘤[5]、腎癌[6]、肝母細胞瘤[7]等中Bcl-2均呈高表達狀態(tài)，且高表達的Bcl-2可抑制細胞凋亡，使細胞生長加速，進而導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。白血病的體外研究表明，在Bcl-2高表達的患者中，白血病細胞生存時間明顯延長，Bcl-2可抑制或阻斷由多種因素介導(dǎo)的細胞凋亡[8]。本組實驗表明，與正常對照組相比，ALL患者中Bcl-2陽性表達率明顯增高，并且不同的臨床危險因素分層差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示：與體外研究相似，Bcl-2對ALL預(yù)后有至關(guān)重要的影響。ALL預(yù)后的評判主要取決于早期治療反應(yīng)的好壞，治療反應(yīng)差者提示單純化療耐藥，屬高危型，預(yù)后不良。本組研究表明，在早期治療反應(yīng)好組與早期治療反應(yīng)差組的兩組病例中，Bcl-2的陽性表達有顯著性差異，并且反應(yīng)差組治療后Bcl-2表達狀況與治療前相比無顯著性差異，與對照組及治療后緩解組相比仍明顯增高，提示Bcl-2蛋白表達可作為臨床評估ALL預(yù)后的一個重要的高危因素，用于早期判斷疾病的預(yù)后，其動態(tài)監(jiān)測結(jié)果可能更有意義。

[1] 歐陽仁榮,沈志祥.血液腫瘤學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1999: 11-43.

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[4] Reed JC.Bcl-2: prevention of apoptosis as a mechanism of drug resistance[J].Hematol Oncol Clin North Am,1995,9(2):451-473.

[5] Kim R, Emi M, Tanabe K, et al.Therapeutic potential of antisense Bcl-2 as a chemosensitizer for patients with gastric carcinoma[J]. J Clin Oncol,2005, 23(16S):4050.

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[8] Reed JC.Bc-l2: prevention of apoptosis as a mechanism of drug resistance[J].Hematol Oncol Clin North Am,1995,9(2):451-473.

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1671-8194（2013）19-0212-02