二甲雙胍對糖尿病大鼠種植體周圍骨組織中OPG和RANKL表達的影響

劉 宇 高 鶯 焦艷軍*

（山西醫科大學研究生院，山西 太原 030001）

二甲雙胍對糖尿病大鼠種植體周圍骨組織中OPG和RANKL表達的影響

劉 宇 高 鶯 焦艷軍*

（山西醫科大學研究生院，山西 太原 030001）

目的 研究二甲雙胍對糖尿病大鼠種植體模型骨組織中OPG和RANKL表達的影響，探討血糖變化對種植體周圍骨整合的意義。方法 將30只8周齡雄性SD大鼠隨機分為正常種植組（T0）、糖尿病種植組（T1）、糖尿病種植二甲雙胍干預組（T2）。糖尿病模型的建立采用高脂高糖飲食喂養以及腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素，種植組植入純鈦種植體，降糖藥物干預組每日二甲雙胍灌胃。每周觀察各組血糖水平，于12周處死大鼠，取脛骨，通過影像學方法觀察種植體周圍骨結合情況，并采用免疫組織化學方法檢測各組種植體周圍骨組織OPG和RANKL表達水平。結果 大鼠T1表達水平比T0和T2組都高，T0和T2組RANKL表達水平相當；在RANKL/OPG比值的兩兩比較中，3組差異都有統計學意義，其值由高到低分別為T1組、T2組和T0組。結論 糖尿病對種植體周圍骨組織整合過程的影響可能是從升高RANKL表達水平和降低OPG表達水平兩方面來起作用的，而二甲雙胍可能通過改變OPG和RANKL的表達，促進種植體周圍骨結合和骨形成。

二甲雙胍；糖尿病大鼠；種植體；OPG；RANKL

口腔種植是用外科手段將人工材料設計的種植體在頜骨內植入，種植體支持義齒的上部結構。人工種植義齒技術的日趨完善，能顯著地提高患者的咀嚼功能，且感覺舒適類似真牙，許多常規義齒難以解決的疑難臨床病例得到滿意療效。

糖尿病是一種能引起以高血糖為特征，具有遺傳傾向，且發病率較高的慢性疾病。有相當多的糖尿病患者伴隨有不同程度的牙列缺損或牙列缺失，因糖尿病可通過多種病理機制影響著種植體周圍的骨整合，因此其被列為口腔種植手術的相對禁忌癥。但隨著人們生活水平的不斷提高，越來越多的糖尿病患者希望通過種植義齒達到改善生活質量的要求，迫使我們在研究糖尿病患者口腔種植手術的適應癥方面做出更多努力。本科題通過研究二甲雙胍對糖尿病大鼠種植體模型骨組織中OPG和RANKL表達的影響，為臨床工作中糖尿病患者種植術前、術后合理用藥，從而達到良好骨整合目的提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

30只8周齡健康雄性成年SD大鼠，二級動物，體質量240～260g，由山西醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 器材及試劑

One Touch快速血糖儀（美國強生）、牙種植機（法國賽特里）、BX-51多功能生物顯微鏡（OLYMPUS公司）、BI-2000醫學圖象分析系統（成都泰盟科技有限公司）、切片機（上海精密儀器有限責任公司）、螺紋柱狀純鈦種植體、種植器械（西安中邦器械有限公司）、鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma公司）、檸檬酸、檸檬酸鈉、2%戊巴比妥鈉（天津市化學試劑三廠）、DAB顯色試劑盒、即用型SABC二抗試劑盒、OPG一抗、RANKL一抗（武漢博士德公司）、鹽酸二甲雙胍片（天津太平洋制藥有限公司），其他試劑及儀器皆為山西醫科大學寄生蟲實驗室提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 建立2型糖尿病大鼠模型

將30只SD大鼠隨機分為正常種植組（T0）、糖尿病種植組（T1）、糖尿病種植二甲雙胍干預組（T2）。常規飼養2周后，T1、T2組高脂高糖飲食4周，T0組繼續給予常規飲食。4周后在禁食12h的狀態下T1、T2組一次性腹腔注射0.5%STZ45mg/kg。T0組注射等量的檸檬酸緩沖液。繼續常規喂養2周后，禁食12h，測量血糖，血糖＞16.7mmol/L視為建模成功，否則給予剔除。

1.3.2 種植體植入及二甲雙胍灌胃

術前禁食12h，采用2%戊巴比妥1mL/kg腹腔注射麻醉，麻妥后將大鼠仰臥固定于手術臺上，右側脛骨備皮，2%碘伏消毒，切開皮膚及皮下組織，尋找脛骨近骺端，距離近骺端5mm處，在生理鹽水沖洗冷卻下，在骨面用1.3mm×5mm的鉆頭制備種植窩（轉速為1200轉/秒），手用器械植入種植體，生理鹽水沖洗創口，分層縫合皮下組織及皮膚。術后3d局部注射青霉素預防感染。種植術后1周，T2組大鼠每日二甲雙胍灌胃（250mg/kg），根據血糖水平每3d調整一次藥物用量使血糖接近T0組水平。T0組、T1組大鼠注射等量生理鹽水。

1.3.3 骨密度檢測

12周后，全麻狀態下進行骨密度檢測。

1.3.4 制作HE切片

切片常規石蠟脫水：二甲苯（I）10min→二甲苯（Ⅱ）10min→100%乙醇2min→95%乙醇1min→80%乙醇1min→75%乙醇1min→蒸餾水洗2min。蘇木素染色5min，自來水沖洗。1%鹽酸乙醇分化30sec（提插數下）。自來水浸泡15min。置伊紅液20sec。自來水洗30sec。脫水，透明:80%乙醇5sec→95%乙醇（Ⅱ）5sec→95%乙醇（I）5sec→100%乙醇5sec→二甲苯（Ⅱ）5sec→二甲苯（I）5sec。樹脂封片。BX-51多功能生物顯微鏡觀察種植體周圍組織學形態。

1.3.5 制作免疫組化切片

切片常規石蠟脫水：二甲苯（I）10min→二甲苯（Ⅱ）10min→100%乙醇2min→95%乙醇1min→80%乙醇1min→75%乙醇1min→蒸餾水洗2min。3%過氧化氫室溫10min。PBS（Ph7.4）液洗3次，每次3min。微波熱修復1 min。滴加5%BSA封閉液，室溫孵育20min。滴加一抗（OPG一抗、RANKL一抗，實驗濃度1∶100），4℃過夜。PBS液（pH7.4）洗3次，每次3min。滴加生物素化兔抗兔抗體 37℃30min。PBS液（Ph7.4）洗3次，每次3min。滴加SABC試劑，37℃恒溫箱 20min。PBS液（pH7.4）洗4次，每次5min。DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒。取1mL蒸餾水，加試劑盒中A、B、C試劑各1滴 ，混均后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應時間，5min后蒸餾水洗終止顯色。蘇木素輕度復染，自來水洗。脫水，透明：80%乙醇5sec→95%乙醇（Ⅱ）5sec→95%乙醇（I）5sec→100%乙醇5sec→二甲苯（Ⅱ）5sec→二甲苯（I）5sec。樹脂封片。BX-51多功能生物顯微鏡觀察種植體周圍骨組織中OPG和RANKL的免疫組化結果。

1.3.6 統計學分析

2 結 果

2.1 實驗動物情況

各組大鼠均健康存活，T1組大鼠明顯消瘦，多飲多食多尿，T2組體質量明顯接近T0組，種植術后3組大鼠種植區創口愈合良好，未見炎癥和感染，種植體未出現松動脫落。T1組組脛骨明顯骨質薄，質地脆，T0組和T2組大鼠脛骨較T1組骨質較厚，質地較韌。

2.2 骨密度檢測檢測結果

結果顯示T1組骨密度值低于T0組和T2組，T0組種植體周圍骨密度較T2組高。

2.3 HE染色觀察結果

T0組與T2組相近，破骨細胞和成骨細胞的數量均多于T1組。T1組破骨細胞數量較其余兩組明顯增多。

2.4 免疫組化結果

T1組OPG表達水平比T0和T2組都低，但T0和T2組OPG表達水平相當；T1組RANKL表達水平比T0和T2組都高，T0和T2組RANKL表達水平相當；在RANKL/OPG比值的兩兩比較中，3組差異都有統計學意義，其值又高到低分別為T1組、T2組和T0組。

3 討 論

在目前臨床工作中，糖尿病患者實施口腔種植手術的風險率一直較高，特別是對于一些血糖控制效果不好的病人，臨床中更將其列為手術絕對禁忌對象。有研究顯示[1]正常人種植體的長期存活率已超過95%，而Fiorellini發現2型糖尿病患者種植體1年以上種植成功率從85.6%到94.3%不等[2]。糖尿病是由于胰島素受體或受體后缺陷導致靶細胞對胰島素的敏感性降低所致，通常認為其通過微血管病變、免疫力下降等病理變化，降低機體組織對致病因子的抵抗力，從而影響骨整合過程。

二甲雙胍是治療胰島素抵抗的重要制劑之一，其降糖作用的主要機制是增加胰島素抵抗患者脂肪細胞、肌細胞的胰島素受體（IR）與胰島素的結合力，促進脂肪、肌肉等周圍組織攝取和利用葡萄糖，抑制肝糖異生及糖原分解，減少肝糖輸出，使血糖下降，同時可抑制脂肪組織分解，降低游離脂肪酸（FFA）水平，減少對β細胞的脂毒性，還可降低血胰島素水平，增高胰島素敏感性[3]。已有研究證明骨組織也為胰島素敏感組織，成骨細胞表面存在高親和性的胰島素受體（IR）[4]，呂嬌[5]等發現二甲雙胍等顯著增強成骨細胞的葡萄糖攝取，在高血糖引起胰島素反應型減弱時，二甲雙胍能逆轉降低的糖運轉活動，使成骨細胞的糖攝取進一步增強。

骨保護素（osteoprotegerin，OPG）又稱為破骨細胞生成抑制因子（osteoclastogenesis inhibitory fanctor，OCIF），其主要功能是抑制破骨細胞的分化，抑制成熟破骨細胞的骨吸收活性并誘導其凋亡。資料顯示OPG是由前肽切除21個氨基酸的信號肽產生，其含有7個功能區（D1～D7），N端的D1～D4區參與配體結合，與抑制破骨細胞的作用直接相關[6]。核因子КB受體活化因子配體（receptor activator of NFКB ligand，RANKL），又稱骨保護素配體（osteoprotegerin ligand，OPGL），能特異性的作用于細胞核因子КB受體活化因子（receptor activator of NF-КB，RANK），從而激活NF-КB，介導骨吸收。OPG/RANKL/RANK系統是介導各種物質誘導破骨細胞生成及功能的最終生物因子，三者共同參與調節破骨細胞的分化成熟和骨吸收重建。成骨細胞及骨髓基質細胞表達RANKL，與破骨細胞前體細胞或破骨細胞表面上的RANK結合后，促進破骨細胞的分化及骨吸收活性。成骨細胞及骨髓基質細胞分泌表達OPG與RANKL競爭性結合，阻止RANKL與RANK之間結合。體內諸多激素和因子通過影響OPG或RANKL的表達影響骨代謝。吳陳炫[7]等研究顯示糖尿病大鼠比非糖尿病大鼠或經胰島素治療的糖尿病大鼠的OPGmRNA表達更低、RANKLmRNA表達更高、PANKL/OPG之比也高。相應的，糖尿病大鼠破骨細胞數比非糖尿病大鼠或經胰島素治療的糖尿病大鼠也更多，提示糖尿病時本身血中異常的激素和細胞因子的改變，有可能改變牙周局部OPGmRNA和RANKLmRNA表達，從而導致牙槽骨破壞。本實驗從OPG和RANKL免疫組化結果來看，T1組OPG表達水平比T0和T2組都低，但T0和T2組OPG表達水平相當；T1組RANKL表達水平比T0和T2組都高，T0和T2組RANKL表達水平相當；在RANKL/OPG比值的兩兩比較中，3組差異都有統計學意義，其值又高到低分別為T1組、T2組和T0組。因此提示糖尿病對種植體周圍骨組織整合過程的影響可能是從升高RANKL表達水平和降低OPG表達水平兩方面來起作用的，而二甲雙胍也可以降低血糖，可能通過改變OPG和RANKL的表達，促進種植體周圍骨結合和骨形成。

[1] Beilker T,Flemming TF. Implants in the medically compromised patient[J]. Crit Rev Oral Biol Med,2003,14(4):305-316.

[2] Fiorellini JP,Chen PK,Nevins M,et al. A restrospective study of dental implants in diabetes patients [J]. Int J Periodontics Restorative Dent,2000,20(4):366-373.

[3] 張軍霞,徐焱成,朱宜蓮.格華止對糖尿病患者高血壓的干預作用[J].浙江臨床醫學,2003,5(1):24-25.

[4] Cornish J,Callon KE,Reid IR. Insulin increasedhistomorphometric indices of bone formation in vivo[J]. Calcif Tissue Int,1996,59(6):492-495.

[5] 呂嬌,劉洪臣,吳璇,等.二甲雙胍對高糖環境下頜骨成骨細胞影響的機制研究[J].上海口腔醫院,2009,18(6):12-13.

[6] 劉長庚,凌天牗,黃生高.OPG/RANKL/RANK系統及其臨床應用[J].國際病理科學與臨床雜志,2007,27(6):534-538.

[7] 吳陳炫,劉士有,王永蘭.糖尿病大鼠牙槽骨RANKL、OPG基因表達的實驗研究[D].天津:天津醫科大學口腔臨床醫學,2007.

R587.1

B

1671-8194（2013）19-0092-03

降糖藥物對糖尿病狀態下植入體穩定性影響的研究（編號：20110321084）；二甲雙胍對體外培養停經后骨質疏松大鼠來源的骨髓間充質干細胞增殖和分化能力的影響（基金號：YB1001）

*通訊作者：E-mail： jiaoyanjun-2000@163.com