納米藥物免疫毒性研究進展

林 曼，洪 敏，王慶利，馬 璟

(1.上海醫藥工業研究院國家上海新藥安全評價與研究中心，上海 201203;2.國家食品藥品監督管理局藥品審評中心，北京 100038)

納米藥物，目前尚無其準確定義，可以理解為三維結構空間中至少有一維處于納米尺度，即1～100 nm的藥物。因此，納米藥物的固有屬性為其具有介觀尺度，表面積大，這使得它具有一些特殊效應，如相對于具有較大尺度的物質，納米顆粒更容易進入生物體并相互作用。一旦進入生物體內，粒徑大小又將影響納米藥物在生物體內停留的部位和方式，進而決定吞噬細胞清除外源物質的途徑。

納米藥物通過呼吸道經肺進入機體后，不可避免地被肺組織中免疫細胞吞噬，引發免疫應答，釋放細胞因子，引發上皮細胞炎癥[1]，未被吞噬清除的納米物質可能逃過免疫系統的監視積累在細胞質或細胞核中[2]。進入生物體后，納米顆粒可滲透細胞膜，穿透組織和淋巴結等，逃脫機體免疫系統的監視[3]。通過胃腸道吸收入血或直接進入血液的納米藥物，首先與血液中的蛋白質結合，而后由多種細胞攝取并作用，導致免疫抑制或免疫增強等[4]。受顆粒性質的影響，納米藥物可通過與特定的免疫細胞結合，或一定的攝取途徑，產生免疫刺激作用。傳統的低毒、無毒物質在納米級別可能導致免疫毒性，如納米晶型石英和纖維可引發免疫毒性[5－6]。納米藥物特有的理化性質也可使得納米顆粒與機體免疫系統之間存在特殊的相互作用，并參加催化、氧化、降解和裂解過程[7]。本文將從納米藥物的免疫學特性、不同類型納米藥物的免疫毒性及其研究方法3個方面進行綜述。

1 納米藥物的免疫學特性

納米藥物對免疫系統產生增強或抑制的不同效應，有可能導致不同的免疫毒性，如不良的免疫刺激、免疫抑制、超敏反應和自身免疫性疾病等。

1.1 免疫刺激

Gubbins等[8]就納米藥物對主要組織器官的免疫細胞的影響進行了系統的總結，包括上皮細胞、樹突狀細胞(dendritic cells，DC)和巨噬細胞。研究顯示，納米藥物被上述細胞攝取后，可激發不同的免疫通路，刺激炎癥物質和細胞因子的產生和釋放。如γ－谷氨酸納米顆粒被DC攝取后，激活髓樣分化因子88介導的NK－κB信號通路，產生白細胞介素－12(interleukin－12，IL－12)p40 和 IL－6，活化抗原特異性的細胞毒T淋巴細胞，在脾細胞誘導產生抗原特異性的干擾素γ(interferon－γ，IFN－γ)，增加血清中抗原特異性 IgG1和IgG2的含量等[9]。此外，吸收入血的納米藥物可能通過刺激血液中補體系統、紅細胞和血小板，激活中性粒細胞，影響巨噬細胞的吞噬活性等[10]，從不同的免疫刺激方面引發免疫毒性。

1.1.1 抗原性

抗原性即刺激免疫系統產生抗體的能力。碳60富勒烯納米粒是一種由碳原子組成的結構，曾嘗試應用于該類藥物設計。研究發現，碳60富勒烯納米粒可刺激多種實驗動物產生特異性抗體，這些特異性抗體由不同的IgG組成;后續研究表明，碳60富勒烯納米粒等可以通過特定機制影響其靶定位置，產生特異性抗體。碳70納米粒也可以產生類似抗體[11－12]。

1.1.2 佐劑特性

有些納米藥物可刺激免疫系統產生更強、更快和更持久的免疫應答。正在研究中的HIV2疫苗使用聚甲基丙烯酸甲酯納米顆粒替代傳統氫氧化鋁作為佐劑，發現聚甲基丙烯酸甲酯納米顆粒組小鼠產生的抗體比氫氧化鋁組和對照組高10～100倍，如IgG和IgM，高濃度抗體維持時間由10周延長至20周[13]。佐劑特性可能增強免疫刺激副作用，產生致命性過敏等，這也是非臨床研究中評價納米藥物免疫安全性的重要方面之一。

1.1.3 炎癥反應

炎癥反應是一個復雜的過程，納米藥物可通過多種通路影響炎癥反應。Lutsiak等[14]報道，乙交酯－丙交酯共聚物(poly－D，L－lactic－co－glycolic acid，PLGA)納米顆粒可以改變小鼠對縮氨酸的免疫應答。小鼠給予經PLGA納米顆粒包裹的乙肝疫苗，對于縮氨酸和弗氏完全佐劑主要產生輔助性T細胞1(helper T cell 1，Th1)型免疫反應;直接給予藥物后主要為Th2型免疫反應。此外，納米藥物可以加快DC的成熟，增加細胞CD80/CD86表達，刺激免疫系統，改變CD4+和CD8+細胞比例，影響炎癥反應，引發不同程度的免疫毒性。

1.2 免疫抑制

免疫抑制表現在T和B細胞增殖減少及免疫器官功能降低等。第3.5代聚合物聚酰胺－胺型樹枝狀高分子屬于固體脂質納米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)，可以抑制Toll樣受體4，抑制DC和巨噬細胞合成的促炎性趨化因子和細胞因子，增加 CD25，CD80，CD83和 CD86的表達，可應用于抑制瘢痕形成，益于術后恢復，將手術的長期成功率從30%增加到80%[15]。

2 納米藥物及其對免疫系統的影響

2.1 納米脂質體

納米脂質體是指在納米級別的、由一層或多層的雙層兩性磷脂分子包裹一種或多種水溶性物質的脂質體[16]。納米脂質體顆粒表面電荷可影響對免疫系統的作用。Nakanishi等[17]發現，在包裹相同濃度抗原的條件下，與呈中性和陰性納米脂質體相比，帶陽性電荷的納米脂質體能更有效地誘導抗原特異性細胞毒T淋巴細胞反應和遲發性超敏反應;陽性納米脂質體藥物可以更有效的進入巨噬細胞和抗原遞呈細胞，產生I型MHC細胞，誘導細胞介導的免疫應答。

2.2 多聚納米粒

多聚納米粒是由可降解的高分子物質、聚合物和膠團組成。在疫苗組分中，通常采用可降解的高分子物質包裹抗原，刺激機體產生特異性抗體。以PLGA為例，其生物降解的給藥系統有很多優勢，如持續釋放藥物，在苛刻的環境中保護包裹的抗原，防止酶類的降解，使給藥具有靶向性且可以與配體結合，有佐劑效應，提高生物利用度等。多聚納米粒普朗尼克是聚丙二醇與環氧乙烷的加聚物，Reddy等[18]在研究納米藥物疫苗時發現，小分子普朗尼克(≈25 nm)可以穩定、高效地進入毛細血管或淋巴管，在DC中作用而后蓄積;而稍大顆粒的普朗尼克(≈100 nm)作用效率則只有小分子的10%，提示納米藥物對小鼠體液免疫和細胞免疫的影響可能與粒徑大小有相關性。

2.3 納米乳劑

納米乳劑為納米級乳滴。納米乳劑可用于疫苗，如乙肝疫苗nano－HBsAg是帶有重組肝炎病毒表面抗原的400 nm油包水型納米乳劑，可誘導Th1型免疫反應，產生細胞因子和趨化因子，刺激細胞產生IgG和黏膜IgA抗體，且免疫應答反應強烈;與傳統氫氧化鋁疫苗相比，其抗體產生量更多，刺激產生抗體的時間更長，更穩定。制成納米乳劑后可透過鼻黏膜給藥，半衰期更長，熱穩定性好，克服了乳化劑本身對溫度不穩定的缺陷，優化了儲存條件和給藥方式[19]。此藥物在美國已進入Ⅰ期臨床試驗。

2.4 固體脂質納米粒

SLN是以固態的天然脂質或合成的類脂等為載體包裹藥物制成的納米載藥系統。Feliu等[22]分析了多種SLN的納米藥物毒性，用人巨噬細胞和粒細胞及嚙齒類巨噬細胞等4種以上的細胞進行體外實驗，從細胞毒性、細胞對納米藥物攝取以及細胞因子釋放等方面對納米藥物毒性進行了研究。研究結果表明，巨噬細胞對SLN的攝取減慢，導致其在血液循環時間延長，進而降低毒性，增加耐受性;不同的脂質載體和不同的濃度可產生不同的免疫效應，SLN載體山崳酸甘油酯納米顆粒的實驗結果表明，高劑量組BALB/c小鼠脾出現組織病理改變，停藥6周后恢復，分析可能與納米藥物在小鼠體內沉積、生物分布廣及代謝較慢有關。

通過研究設計不同類型的納米藥物以得到所需的免疫效應，可用于疫苗和抗腫瘤免疫增強作用，避免其副作用或不期望的免疫效應。如Pan等[21]在研究抗腫瘤藥物時發現，納米脂質性包裹的抗腫瘤藥物G3139，可增加藥物本身導致的IL－6和IFN－γ等細胞因子的釋放，促進 NK細胞和DC增殖，提高抗腫瘤效應。

3 納米藥物免疫毒性的研究方法

已知納米藥物的毒性與其特有的理化性質相關，但尚無明確的以結構相關為基礎的毒理學研究[22]。納米藥物的毒性研究仍然著重case－by－case原則。加之免疫系統是由多個免疫器官、免疫細胞和免疫分子構成的復雜系統，因此，體內實驗需要從不同免疫器官和細胞因子著手，關注動物整體的血液學、生物化學和免疫器官組織病理學等變化。

3.1 細胞實驗

通過對不同免疫細胞的細胞毒性測試，可檢測納米藥物對細胞半數致死濃度、免疫細胞增殖和分化等方面的影響。

Shaw等[23]采用不同的實驗方法、細胞類型和濃度系統地評價了50多種納米材料，旨在提供廣泛的納米藥物作用機制，如細胞因子和趨化因子的產生釋放及特異性抗體的產生等，為預測納米材料毒性并進行毒性分級提供實驗數據。此外，體外三維實驗方法可模擬體內細胞的反應，如Huh等[24]建立了“芯片中的肺(lung－on－a－chip)”的方法，重建人類肺泡復雜完整的微環境;并應用于研究納米硅顆粒經上皮細胞和內皮細胞攝取、循環及發生炎癥的機制。實驗發現，在lung－on－a－chip的實驗中，納米硅顆粒可誘發人肺泡上皮細胞炎癥因子表達增加，中性粒細胞停留在上皮細胞并累積，產生免疫應答，導致免疫毒性等。

3.2 細胞因子

細胞因子如白細胞介素和腫瘤壞死因子的合成釋放與正常相比的增加或減少均可用于評價免疫毒性。如Lucarelli等[2]在比較研究納米顆粒免疫毒性時發現，SiO2，TiO2和ZrO2納米顆粒可導致IL－1β，腫瘤壞死因子α和IL－1α表達增加或減少，產生不同的免疫毒性。細胞因子含量可以通過ELISA測定。

3.3 毒理組學研究

除了常規的體內外實驗，組學技術為研究納米藥物免疫毒性研究提供了新的技術和方法。納米碳管是由碳原子組成的立體結構的納米材料，和納米富勒烯碳一樣，曾用于研究納米藥物載體并開發用于癌癥治療，但研究中發現對不同動物不同器官有細胞毒性，產生特異性抗體，導致免疫反應。Ding等[25]將人成纖維細胞暴露于納米碳管后，進行全基因組學研究，發現暴露多壁納米碳管的細胞均有不同基因和基因表達量的改變，在表達譜中表達增多的主要是與抗病毒免疫應答有關的人類黏病毒流感抗性基因1和2小鼠及與自身免疫改變有關的干擾素誘導蛋白1(interferon－induced protein with tetratricopeptide repeats，IFIT1)，IFIT2 和 IFIT3，表明納米藥物可以從基因水平影響動物免疫系統。Haniu等[26]通過蛋白質組學方法辨別多壁納米碳管暴露下多種蛋白質合成，包括熱激蛋白、中性α糖苷酶和DNA錯配修復蛋白Msh2等，這些蛋白質都可能影響免疫系統在內的生物系統，表明蛋白質組學技術在納米藥物的免疫毒性評價中有重要的應用價值。

3.4 其他

免疫表型分析、T細胞依賴性抗體反應、NK細胞活性分析、巨噬細胞/中性粒細胞功能和細胞免疫分析法等都是測試特定細胞的數目、表型、活性和功能用以評價納米藥物免疫毒性的方法[26]。遲發型超敏反應用淋巴結增殖實驗評價，納米藥物經皮下注射后，可以通過淋巴結進入淋巴系統，第7天注射[3H](胸腺嘧啶核)苷，通過淋巴結細胞增殖判斷是否誘發遲發型超敏反應。皮下注射的納米藥物可以進入不同淋巴結，由DC攝取遞呈后，產生共刺激分子和Ⅱ型主要組織相容性復合體(MHC)，進而產生遲發型超敏反應。

CH50補體激活實驗測定補體激活功能，補體激活導致血清中補體成分減少，降低裂解紅細胞的能力，從而測得補體激活能力的大小，測得納米藥物的免疫毒性。補體激活的免疫系統可以激活其他免疫細胞產生免疫應答，產生潛在的免疫毒性[17]。

不同物種對納米藥物的免疫毒性反應不同，如補體激活實驗采用靈長類動物恒河猴或斑馬魚胚胎模型研究納米藥物的免疫毒性更加方便。無論體內體外實驗，納米藥物免疫毒性研究仍需要以組織病理學檢查為“黃金標準”，在組織病理學驗證的基礎上，通過檢測免疫系統的不同器官、組織和細胞等可以全方位的評價納米藥物的免疫毒性。

4 展望

納米技術作為新型藥物遞送系統，可能會實現靶向給藥，改善吸收，延緩藥物釋放，延長藥物作用時間，減少藥物在胃腸道代謝，提高生物利用度，并降低不良反應。目前該類制劑多處于體外及動物體內實驗階段，雖然部分藥物已進入臨床試驗，但上市品種很少，可能源于納米制劑給藥后仍有一些非預期的生物機體反應。納米藥物開發需重視立題，考慮臨床需求，同時對其藥代動力學、安全性和有效性等進行全面評估，納米藥物的非臨床評價需要結合藥學處方工藝和質控來考慮，其中免疫毒性是其中重要內容之一。

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