HIF-2α在1歲牦牛肺臟的表達分布研究

張忠華，劉素平，譚紫仙，楊 琨

（西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 榆中 730124）

牦牛是青藏高原地區標志性的土著動物之一，是已經在形態和生理上適應了青藏高原高寒、低氧環境的牛種，也是青藏高原地區各種生活資源的主要來源之一。

低氧誘導因子家族（HIFs）是一類重要的適應性低氧反應的調控因子[1]。低氧誘導因子2α（hypoxia inducible factor-2α，HIF-2α）是低氧誘導因子家族的異構體之一，是肺血管對急性和慢性低氧做出反應的重要調節因子，具有調控血管再生的功能，包括細胞增殖、血細胞成熟、血管生成、肺血管發育和胚胎發育等[2，3]。在高寒和低氧條件下，適量的增加低氧誘導因子2α在牦牛肺臟器官的含量能夠提高細胞對低氧的適應力，使ATP產能增加、減少氧化物產量[4]。

該研究以1歲牦牛的肺臟為試驗材料，通過免疫組織化學染色和HE染色的方法檢測HIF-2α蛋白在牦牛肺臟中的表達分布并為牦牛的低氧研究提供形態學資料，為HIF-2α在高原動物適應高寒低氧環境生化機制的研究奠定良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為1歲健康牦牛的肺臟組織，在牦牛被放血后立即收集,并用4%多聚甲醛溶液立即固定采集的組織。材料于2018年5月份在西寧屠宰場獲取。

1.2 材料處理

取大約1 cm3的肺臟組織制成石蠟切片（厚4～5 μm），用于HE染色和免疫組織化學染色試驗。

1.3 試驗試劑

主要的試驗試劑包括HIF-2α兔多克隆抗體（bs-1447R）、SP試劑盒(兔)（SP-0023）和DAB染色試劑盒（C02-04001，均購于北京博奧森生物技術有限公司。

1.4 免疫組化檢測

采用HIF-2α兔多克隆抗體作為HIF-2α抗體，按1∶100的比例稀釋，加入一抗(HIF-2α兔多克隆抗體)的組織在37℃環境下孵育2～3 h。試驗操作步驟根據SP試劑盒和DAB染色試劑盒的說明書進行。陰性對照試驗不加HIF-2α兔多克隆抗體。

1.5 結果判定

免疫組織化學染色的結果分為強陽性表達、中性陽性表達、弱陽性表達和陰性表達。顯色結果為深棕黃色是強陽性表達、棕黃色比背景色深是弱陽性表達、位于強陽性和弱陽性之間為中性陽性表達、陰性表達為棕黃色。

2 結果

2.1 牦牛肺臟的組織學結構

牦牛肺臟HE染色及HIF-2α蛋白免疫組化染色如圖1所示。通過對HE染色的肺臟組織切片進行組織學觀察，1歲健康牦牛肺臟的肺泡壁較薄，由Ⅰ型上皮細胞襯覆。牦牛肺臟具有豐富的肺泡，近似為多面形或半球形的囊泡結構，并且開口于肺泡囊和呼吸性細支氣管等，肺泡間有大量的毛細血管網，如圖A所示。

圖1 牦牛肺臟HE染色及HIF-2α蛋白免疫組化染色

2.2 免疫組織化學檢測VEGF蛋白表達

在1歲牦牛肺臟組織中，免疫組化染色結果顯示HIF-2α蛋白在血管外膜、肺泡導管、終末支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞中為強陽性表達，在肺泡I型細胞、肺泡II型細胞、呼吸性細支氣管上皮細胞、肺血管和肌細胞中為陽性表達（詳見圖B）；陰性對照無陽性反應（詳見圖C）。

3 討論

牦牛是高原地區的典型動物，在高寒低氧環境下生活的牦牛已在形態和生理上適應了高原的嚴酷條件[4]，牦牛的肺臟在結構方面與生活在低海拔地區動物的肺臟相比具有差異，牦牛肺臟的肺血-空氣屏障比低海拔的動物都要薄，這有利于增加氣體交換過程中的氧擴散；當生活在低海拔的黃牛暴露在高海拔環境下時，很容易發生嚴重肺動脈高壓和右心衰竭[5]；與奶牛和黃牛的血管外徑與肺微動脈中膜的平滑肌厚度的百分比相比，牦牛的百分比更小，這說明高原地區的牦牛肺動脈高壓，牦牛更適合在高海拔的環境下生活[6]。

氧氣是調節HIF-2α表達的關鍵因素[1]，且HIF-2α是細胞對低氧適應和肺血管對急性和慢性低氧做出反應的重要調節因子[2]。在正常的氧濃度水平時HIF-2α的表達量較低，僅具有維持血管密度平衡的作用，然而在缺氧時HIF-2α的表達量顯著升高，有學者發現HIF-2α的缺失能夠導致致命的呼吸窘迫綜合征（RDS），這是由于肺泡II型細胞表面活性劑生產不足所導致的[7]。試驗結果發現HIF-2α在1歲牦牛肺臟中血管外膜、肺泡導管、終末支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞的表達量很高，表明低氧能夠提高HIF-2α在1歲牦牛肺臟中的表達水平，進而影響牦牛的肺功能，這可能是牦牛能在高寒低氧的環境下生存的重要影響因素。

4 結論

本試驗通過研究HIF-2α在1歲牦牛肺臟中的表達分布情況，發現該蛋白于牦牛肺臟中血管外膜、肺泡導管、終末支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞高表達，結合HIF-2α對肺臟血管有促進功能，得出低氧能促進HIF-2α在牦牛肺臟中的表達，進而推測HIF-2α因子對牦牛適應高原低氧環境有著重要作用。