蜂膠及其活性成分抗心肌細胞氧化性損傷作用探析

■ 葛苗苗 孫麗萍 徐響 杜夏 王馨

（作者葛苗苗單位為中國農業科學院蜜蜂研究所，福建農林大學蜂學學院；孫麗萍、徐響單位為中國農業科學院蜜蜂研究所，農業部國家蜂產品加工專業分中心；杜夏、王馨單位為中國農業科學院蜜蜂研究所）

蜂膠是西方蜜蜂采集植物樹脂后，混入蜂蠟和其它分泌物經加工咀嚼而成的一種粘稠物質。蜂膠作為一種天然活性物質，其成分極其復雜，具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種生物活性，是作為保健食品、藥品制品的重要活性成分。

隨著人們飲食結構的改變、空氣質量不斷下降以及我國老齡化現象的加劇，心血管疾病已逐漸成為威脅我國公民健康的重大疾病之一。心血管疾病的發病機制極其復雜，其中氧自由基引起的心肌細胞氧化性損傷是造成心血管系統結構與功能異常的重要原因之一。大量研究證實，許多心血管疾病的病理過程中都有過量的氧自由基產生，氧化應激狀態下的活性氧自由基代謝紊亂是心肌細胞損傷甚至壞死的重要觸發因素。因此，抗心肌細胞氧化性損傷是研究心血管疾病防治的重要切入點。本文對采用不同的氧化損傷模型研究蜂膠及其活性成分對心肌細胞氧化損傷的作用進行了總結。

抗氧化作用

蜂膠中含有多種活性成分，目前已鑒定出300多種物質，包括黃酮類、萜烯類、芳香酸及其衍生物、氨基酸、醛酮類物質，還有多種烴類物質、維生素、礦物質微量元素和酶等。蜂膠中的多酚物質極其豐富，并已鑒定出70多種黃酮類化合物，酚酸及其酯類近60種。研究表明，黃酮類物質、萜烯類物質和酚酸及其衍生物是蜂膠中的主要活性成分。因蜂膠黃酮結構中具有各種不同取代位置的酚羥基、不飽和鍵等，使其具有較高的抗氧化活性。

目前，國內外研究人員從蜂膠中分離、純化出若干組分物質及化合物并采用體外氧化實驗研究了其抗氧化作用。Katsuhiro H 等在分離蜂膠抗氧化成分時發現，蜂膠抗亞油酸氧化的能力較強，成分以artepillin C的含量最高。Nagai T等的研究表明，蜂膠的黃酮類化合物具有很強的供氫能力，它的抗氧化性優于茶多酚、丁基烴基甲苯(BHT)、沒食子酸丙酯(PG)和丁基烴基茴香醚(BHA)，與維生素E相近。有實驗進一步研究了蜂膠抗氧化能力與多酚含量的量效關系，并發現咖啡酸衍生物、槲皮苷、兒茶酚等物質對蜂膠抗氧化活性的關系密切。Rapta P等在證明了蜂膠醇提液中黃酮類和咖啡酸酯類具有較強的清除自由基和抗氧化能力的同時，采用測定氧化還原電勢的方法分析出高良姜素、白楊素、咖啡酸苯乙脂（CAPE）和槲皮素等活性成分具有明顯的抗氧化活性。

抗心肌細胞氧化性損傷的作用

現代臨床表明，蜂膠除了具有抗菌消炎、治療口腔疾病、抑制腫瘤和護肝作用外，還有使心臟肌肉抵抗阿霉素損傷、改善心血管系統的血液循環，預防和輔助治療高血壓、冠心病等作用。而氧自由基過量產生或機體內抗氧化防御機制減弱造成的自由基堆積可引起心肌細胞氧化性損傷，是多種心血管疾病發生與演變的重要細胞學基礎。因此，利用蜂膠的抗氧化性預防心血管疾病的發生及發展是許多相關領域研究的重點。目前，研究過程中廣泛使用的氧化損傷模型有藥物損傷、H2O2損傷、化學損傷以及電輻射等。

對藥物誘導的心肌細胞氧化性損傷作用

抗生素是微生物或高等動植物在生命活動中產生的一類次級代謝產物，廣泛應用于各種惡性腫瘤治療。但長期服用會產生劑量依賴性心臟中毒，誘發嚴重心臟毒性，甚至導致心力衰竭或心臟停搏。關于抗生素引起的心臟中毒分子機制還未涉及，但其誘導的氧化應激反應機制已被多位學者證實。醫學臨床應用較廣泛的抗腫瘤抗生素有阿霉素、柔紅霉素和鏈唑霉素等。在建立藥物損傷模型時，一方面可以利用實驗動物建立體內氧化損傷模型，另一方面可通過原代細胞培養和H9C2細胞株的傳代培養建立體外氧化損傷模型。

體內氧化損傷模型的建立主要采用靜脈、腹腔注射和口服的方式給藥，并根據實驗目的選用藥物預處理或者后處理方式。Chopra S等采用阿霉素Wiser成年大鼠損傷模型研究蜂膠醇提物對心肌氧化性損傷的作用。實驗中連續5d以50、100 mg/kg的劑量向大鼠體內靜脈注射蜂膠醇提物，并于第5d注射10 mg/kg的阿霉素致損，30 mg/Kg的蘆丁為陽性對照。24h后收集血液和心臟組織進行生化指標檢測和生理病理的研究。結果經蜂膠醇提物預處理后，受損鼠血清中的肌酸激酶（CK）、血液和組織中的谷胱甘肽（GSH）以及心臟中硫代巴比妥酸還原產物（TBARS）的水平明顯降低。Okutan H等以35 mg/kg的濃度向鼠體內連續3d靜脈注射鏈唑霉素（STZ），之后連續8周每天以10 μmol/L的劑量靜脈注射CAPE，通過檢測心肌組織中MDA、SOD、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）研究CAPE抗心肌氧化損傷的作用。與空白組相比，CAPE處理組鼠的心臟組織中MDA含量顯著降低；與未經CAPE后處理的損傷鼠相比，CAPE處理組鼠的心臟組織中SOD和CAT活性降低但GSH-Px活性顯著提高。從而得出CAPE通過其抗氧化活性可明顯改善心肌細胞的氧化應激損傷。

在體外氧化損傷模型建立方面，需要有目的性地選擇原代培養心肌細胞或者采用細胞株進行實驗。相關實驗結果表明，在蜂膠活性的驗證方面，兩種細胞的實驗結果是一致的。Mojzisová G 等通過體外培養成年鼠的心肌細胞，測定LDH漏出率和采用MTT法檢測細胞存活率比較槲皮素、松樹皮萃取物和4,5,7-三氫黃烷酮抗柔紅霉素誘導的心肌中毒作用，生育酚為陽性對照。各黃酮類物質與柔紅霉素共同孵育24h后，10-4～10-6mol/L濃度范圍內的槲皮素和4,5,7-三氫黃烷酮都可顯著提高心肌細胞的存活率，松樹皮萃取物的活性稍差。另一方面，所檢測黃酮類物質都可抑制柔紅霉素誘導的LDH漏出率，且活性明顯高于生育酚。Zisová G采用H9C2細胞株比較以上幾種黃酮類物質抗心肌細胞毒性的作用。結果與柔紅霉素共同孵育24h后，槲皮素在10-4～10-5mol/L的濃度范圍內可明顯提高心肌細胞的存活率。而其他化合物只是在最高濃度下有保護作用；共同孵育48h后，槲皮素和4,5,7-三氫黃烷酮可在10-4～10-5mol/L明顯降低細胞的死亡率，而松樹皮萃取物和生育酚在此濃度范圍內的心肌細胞保護作用較弱。實驗結果還表明，槲皮素和4,5,7-三氫黃烷酮可抑制心肌細胞凋亡。此實驗同樣證明了槲皮素是一種有效的抗心肌細胞氧化損傷的化合物，與原代心肌細胞的實驗結果具有可比性。因此，H9C2細胞株可作為一種有效的心肌細胞外損傷模型。

國內學者多采用體外氧化損傷模型用于蜂膠活性的驗證，并取得一致性的結果。原代培養的大鼠乳鼠心肌細胞作為實驗材料，柔紅霉素和不同濃度（25、50、100 μmol/L）的槲皮素共同孵育24h后，吉姆薩染色后顯微鏡下觀察細胞形態變化，流式細胞儀下檢測細胞凋亡率，并采用相應的試劑盒檢測LDH、SOD和MDA等與氧化相關的指標。結果與柔紅霉素損傷組相比，經槲皮素處理的心肌細胞碎片減少，細胞凋亡率、LDH和MDA的含量降低，SOD活性和線粒體脫氫酶活性增高，且存在劑量效應關系。

對H2O2誘導的心肌氧化損傷的作用

H2O2是超氧陰離子自由基歧化生成的一種氧化能力很強的活性氧，它與細胞內鐵離子通過Fenton反應生成高活性的羥自由基且通過級聯反應生成更多自由基。外源性H2O2易于獲得、性質相對穩定，且極易透過細胞膜，其作用于心肌細胞后破壞心肌細胞膜、影響線粒體功能、造成細胞供能障礙，是研究蜂膠抗氧化作用的重要工具。

H2O2處理多為體外氧化損傷，可更有效地研究蜂膠抗心肌氧化損傷的作用。Sun X等用不同濃度的木犀草苷預處理H9C2細胞4h，150 μmol/L H2O2孵育6h后進行形態學研究和生化指標的測定，用于研究木犀草苷對H2O2誘導的心肌細胞凋亡的作用并從細胞學、形態學和分子水平上研究其抑制細胞凋亡的作用機制。結果木犀草苷可通過增強SOD、GSH-Px以及CAT的活性，明顯減少細胞凋亡率，提高抗凋亡蛋白Bcl-2、降低凋亡蛋白Bax的表達量，抑制凋亡因子的釋放量，調節H2O2誘導的線粒體功能紊亂。數據還表明木犀草苷可通過顯著抑制JNK和P53蛋白的表達量來抑制細胞凋亡。采用相同的H2O2損傷條件，研究異鼠李素對H9C2細胞的作用結果顯示，0～25 μmol/L的異鼠李素對心肌細胞的保護作用呈劑量依賴性，并將25 μmol/L篩選為后續細胞凋亡率以及與凋亡機制相關指標測定時的預處理濃度。最終結果表明，異鼠李素抑制細胞凋亡的機制可能與激活Caspase-3、9，維持線粒體膜電勢，調節Bcl-2家族基因表達以及可使與細胞凋亡通路相關的ERK和P53失活有關。

Akhlaghi M等采用H9C2心肌細胞模擬心肌缺血-再灌注損傷和叔丁基H2O2損傷，比較5種黃酮類物質對受損心肌細胞的保護作用。采用顯微觀察和觀察甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的活性直接和間接地測定細胞存活率。在缺血-再灌注損傷之前，用不同劑量的黃酮類物質對心肌細胞預處理2-3d。結果兒茶酚具有明顯的保護作用，槲皮素在5 μmol/L下有保護作用，但濃度增加會對細胞產生毒性。在氧化損傷模型中，用400 μmol/L濃度的H2O2氧化損傷24h前，在25 μmol/L黃酮類物質的長時預處理（3d）中，只有槲皮素具有顯著的保護作用，而其他物質則表現出較明顯的細胞毒性；在50 μmol/L濃度下的短時預處理（1h）中，黃酮類物質沒有表現出明顯的細胞毒性，且除槲皮素外，兒茶素也表現出明顯的保護作用。結果表明，兒茶素可有效預防缺血-再灌注損傷，槲皮素則對預防心肌心肌的氧化應激損傷效果明顯。

選用原代培養的乳鼠心肌細胞作為實驗材料的實驗結果同樣證明了，槲皮素可減少H2O2導致的心肌細胞形態學變化，降低LDH漏出率和MDA產生量，保護SOD活性，具有抵抗細胞氧化損傷的作用。

對化學損傷誘導的心肌細胞氧化損傷的作用

Nabavi SF向鼠體內連續7d靜脈注射10 和 20 mg/kg的槲皮素，之后以600ppm的劑量連續7d靜脈注射氟化鈉，測定心臟組織上清液中的SOD、CAT和還原性GSH活性等指標，研究槲皮素對氟化鈉誘導的心臟氧化損傷的保護作用。結果，心臟經槲皮素預處理后其與氧化有關的指標明顯改善。

金毅等采用聚酰胺柱層析分離得黃酮含量為22.5%蜂膠黃酮類提取物，Fe2+/半胱氨酸損傷原代培養的SD大鼠心肌細胞，研究蜂膠對氧化損傷心肌細胞的保護作用，并以槲皮素為陽性對照。細胞經25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL的蜂膠黃酮提取物和25 μg/mL的槲皮素預處理1h，加入Fe2+/半胱氨酸損傷24h后，測定細胞中MDA含量、SOD活性和LDH漏出率。2008年，隋玲娟用改良的聚酰胺柱層析方法和同樣的氧化損傷模型比較了蜂膠醇提物和槲皮素對氧化損傷性心肌細胞的保護作用。結果，蜂膠醇提物的過氧化損傷和保護SOD活力的作用強于槲皮素，但對心肌細胞的脂質過氧化反應的抑制作用則弱于槲皮素。

對其他因素誘導的心肌細胞氧化損傷的作用

電磁輻射通過提高自由基影響生物系統，增強脂質過氧化反應，改變人體組織抗氧化防御系統，從而導致氧化應激反應。因此有學者用動物模型研究CAPE對900MHZ電磁輻射誘導的心肌細胞氧化損傷的作用，CAPE處理組在接受輻照之前每天注射CAPE，劑量為10 μmol/mL，每天900MHZ電磁下輻照30min，連續輻照10天，電磁輻射組中，MDA和NO水平提高，SOD、CAT以及GSH-Px活力降低。CAPE處理組可明顯將結果轉變。

另有學者選用連續超負荷訓練4周的小鼠為實驗材料，研究蜂膠黃酮對疲勞誘導的心肌自由基代謝和ATP酶的影響。從處死小鼠提內取出心臟，勻漿化，離心去上清液，測定MDA、SOD、GSH-Px、CAT以及ATP酶的活性。結果蜂膠黃酮處理組小鼠SOD、GSH-Px、CAT的活性均明顯高于對照組，而MDA含量則低于對照組，并明顯抑制了由疲勞導致的ATP酶活性的降低。從而得出蜂膠黃酮可提高機體抗氧化能力，減少自由基對細胞的氧化性損傷。

目前，蜂膠抗心肌細胞氧化作用的研究還處于初級階段。所用的氧化損傷模型多數采為H2O2損傷和阿霉素、柔紅霉素等抗生素氧化損傷。對化合物的活性研究方面，也僅涉及了蜂膠中含量較高或者活性較明顯的化合物。而誘導心肌細胞氧化應激反應的因素是多方面的，且各因素的主要氧化機制也不盡相同。蜂膠作為一種天然活性物質，其成分極為復雜，且不同的產地、不同的膠源物質以及不同的采集季節，蜂膠的化學成分存在差異，蜂膠的抗氧化作用也存在差異。因此，蜂膠的活性驗證及抗心肌細胞氧化損傷的機制研究還需要更全面、深入、系統化。