殼聚糖及丁二酸酐酰化殼聚糖雙氧水降解行為的研究

代元坤，賀繼東，安 康，肖 嫻，劉 朋，況 波

（青島科技大學 橡塑材料與工程教育部重點實驗室山東省橡塑材料與工程重點實驗室，山東 青島266042）

殼聚糖（Chitosan，CS）是一種天然高分子堿性多糖，由甲殼素部分脫乙酰制得，分子量從幾十萬到幾百萬不等。由于具有優良的物理化學性能及生物相容性能，廣泛應用于食物、農業、制藥及化妝品等領域［1］。

殼聚糖溶解性差，只溶于稀的鹽酸、硝酸等無機酸和大多數有機酸，不溶于水和堿性溶液，化學性質不活潑，使得其應用受到很大的限制。經過降解后的低聚殼聚糖分子量（Mw＝1000～10 000）較小，不僅保持了高聚殼聚糖所具有的功能，如降低膽固醇、降血壓、降血脂、防治糖尿病、強化肝臟機能、治療燒燙傷等，而且還具有許多高聚殼聚糖所不具備的生理活性和功能，如保濕性、免疫調節、防癌、調節腸道菌群、抗菌防腐、作為功能性甜味劑及營養強化劑載體、排除體內有毒有害物質、誘導植物產生抗毒素等。

殼聚糖的降解方法分為物理降解法、生物降解法和化學降解法等。物理降解法包括輻射降解法［2］、光降解法［3］、超聲波降解法［4，5］。生物降解法所采用的降解酶包括能專一性地催化水解甲殼素、殼聚糖的酶，主要有甲殼素酶、殼聚糖酶以及能脫除甲殼素中乙酰氨基上的乙酰基的脫乙酰基酶；另外，非專一性的水解酶如蛋白酶、脂肪酶、溶菌酶、纖維素酶、半纖維素酶等對甲殼素和殼聚糖也有降解功能［6－10］。化學降解法主要包括酸降解法［11，12］和氧化降解法［13］等。

作者采用丁二酸酐制備酰化殼聚糖，然后在雙氧水氧化降解體系下制備低分子量殼聚糖和低分子量丁二酸酐酰化殼聚糖；討論該體系下殼聚糖及丁二酸酐酰化殼聚糖的降解速率，通過紅外光譜分析雙氧水對低分子量殼聚糖和低分子量丁二酸酐酰化殼聚糖結構的影響。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

殼聚糖（脫乙酰度為81%），青島利中甲殼質公司；鹽酸（質量分數36%～38%）、雙氧水（30%）、無水Na2CO3、冰乙酸、丁二酸酐等均為分析純。

烏氏粘度計；TENSOR－27型傅立葉紅外光譜儀（KBr壓片），德國BRUKER公司。

1.2 方法

1.2.1 丁二酸酐酰化殼聚糖（CHS）的制備

稱取干燥好的殼聚糖2g置于三口燒瓶中，加入150mL水，稱取無水碳酸鈉2g及一定量丁二酸酐，混合均勻后，分4次（每30min加1次）加入反應體系，在常溫下攪拌反應3h。反應停止后將產物倒入燒杯，用NaOH溶液調至堿性，使沒反應完的殼聚糖沉淀析出，離心，去沉淀。濾液用HCl調至酸性，酰化殼聚糖析出，過濾，沉淀用大量的丙酮浸泡，過濾并沖洗3次，在通風櫥中放置2d，最后于60℃真空烘箱中干燥2h，即得丁二酸酐酰化殼聚糖。

1.2.2 低分子量殼聚糖（LCS）的制備

取0.500g殼聚糖、0.6mL冰乙酸及一定體積去離子水加入三口瓶中，60°C恒溫，一次性加入5%（體積分數，下同）雙氧水，反應總體積為100mL，在氮氣保護下反應。從開始反應起每隔50min移取2mL反應液于試管，靜置。反應結束后調pH值為堿性，加甲醇沉淀，過濾，將白色沉淀用甲醇洗3次，于60℃真空烘箱中干燥，即得低分子量殼聚糖。

1.2.3 低分子量丁二酸酐酰化殼聚糖（LCHS）的制備

取4g丁二酸酐酰化殼聚糖溶于150mL去離子水中，調pH值為中性，攪拌下加入5%的雙氧水50mL，60℃恒溫降解。從開始反應起每隔30min移取2mL反應液于試管，靜置。反應結束后調pH值為中性，加3倍的甲醇沉淀，過濾，將白色沉淀用甲醇洗3次，于60℃真空烘箱中干燥，即得低分子量丁二酸酐酰化殼聚糖。

1.2.4 分子量的測定

溶劑的配制：配制0.2mol·L－1CH3COOH＋0.1mol·L－1CH3COONa溶劑50mL，用G3型砂芯漏斗過濾，恒溫待用。

待測溶液的配制：分別取2mL靜置后的樣品，用0.2mol·L－1CH3COOH＋0.1mol·L－1CH3COONa溶劑配成20mL 0.05%的待測溶液，經G3型砂芯漏斗過濾到干燥的50mL容量瓶中，恒溫待用。

特性粘度（［η］）的測定：將烏氏粘度計垂直固定于（25±0.02）℃恒溫水浴中，移取10mL過濾好的待測溶液注入其中，恒溫10min，使待測溶液溫度與水浴溫度達到平衡后，測試待測溶液的流出時間t，實驗結束后測定溶劑的流出時間t0。

分子量（M）的測定：王偉等［14］測定的此溶劑體系下脫乙酰度為84%的殼聚糖溶液的K值為1.424×10－3、α值為0.96，因此，可按公式［η］＝KMα＝1.424×10－3M0.96計算分子量。

2 結果與討論

2.1 紅外光譜分析

2.1.1 殼聚糖及丁二酸酐酰化殼聚糖的紅外光譜（圖1）

圖1 殼聚糖及丁二酸酐酰化殼聚糖的紅外光譜Fig.1 The IR spectra of CS and CHS

由圖1可看出，丁二酸酐酰化殼聚糖在3389cm－1、1557cm－1、1737cm－1左右出現了比較明顯的吸收峰，其中3389cm－1處是酰胺鍵中N－H的伸縮振動峰、1737cm－1處是酰胺鍵中C＝O的伸縮振動峰、1557 cm－1處是酰胺鍵中N－H的彎曲振動峰。由此說明在氨基上發生了酰化反應。由圖1還可看出，殼聚糖酰化后在1082cm－1處的－OH峰值變小，說明也有一部分反應發生在羥基上。

2.1.2 殼聚糖及其降解產物的紅外光譜

殼聚糖在降解過程中除發生糖苷鍵斷裂外，還可能存在開環等副反應，如果副反應過多，會影響殼聚糖的基本結構，則無法保持殼聚糖的原有性質。殼聚糖及其降解產物的紅外光譜如圖2所示。

圖2 殼聚糖及其降解產物的紅外光譜Fig.2 The IR spectra of CS and LCS

由圖2可看出，殼聚糖降解后，－NH2、－OH的特征吸收峰依然存在，且－N－H剪式振動和－NH2伸縮振動更明顯，說明降解后殼聚糖單元基本結構沒有發生明顯變化，只是糖苷鍵斷裂，分子量降低，某些特征吸收峰（如－NH2）變強。

2.1.3 丁二酸酐酰化殼聚糖及其降解產物的紅外光譜（圖3）

圖3 丁二酸酐酰化殼聚糖及其降解產物的紅外光譜Fig.3 The IR spectra of CHS and LCHS

由圖3可以看出，丁二酸酐酰化殼聚糖降解后，酰胺鍵的特征峰沒有發生變化；在2944cm－1、1663cm－1處分別出現了醛基的C－H、C＝O伸縮振動峰，表明在降解過程中生成了醛基；在811cm－1處的糖環峰無明顯變化，表明雙氧水降解并沒有破壞吡喃糖環；在1000cm－1左右的C－O－C伸縮振動峰強度變弱，表明主鏈的C－O－C部分斷裂。

2.2 殼聚糖及丁二酸酐酰化殼聚糖的降解速率

殼聚糖及丁二酸酐酰化殼聚糖在雙氧水中降解時的分子量與降解時間關系曲線見圖4。

圖4 降解產物分子量與降解時間的關系Fig.4 The relationship between molecular weight of degraded products and degradation time

由圖4可知，對于殼聚糖和丁二酸酐酰化殼聚糖，降解主要發生在反應開始后的2～3h內，之后降解產物的分子量趨于穩定，約為20 000。在降解反應開始時，殼聚糖與丁二酸酐酰化殼聚糖的降解速率基本一致，當反應進行到一定程度后，殼聚糖的降解趨于終止，而丁二酸酐酰化殼聚糖降解產物的分子量仍在下降。表明在相同的雙氧水濃度及降解溫度下，丁二酸酐酰化殼聚糖的降解程度相對殼聚糖更大，說明殼聚糖經丁二酸酐酰化之后在雙氧水體系中更容易發生降解。

3 結論

在簡單均相體系下，采用雙氧水降解殼聚糖所得低分子量產物基本保持了高分子量殼聚糖的結構特征。當雙氧水體積分數為5%、降解溫度為60℃時，殼聚糖及丁二酸酐酰化殼聚糖的氧化降解主要在反應開始后的2～3h內完成，能得到分子量為20 000左右的降解產物。同時，在相同條件下，丁二酸酐酰化殼聚糖更容易在雙氧水體系中發生降解。

［1］Rinaudo M.Chitin and chitosan：Properties and applications［J］.Progress in Polymer Science，2006，31（7）：603－632.

［2］Choi W S，Ahn K J，Lee D W，et al.Preparation of chitosan oligomers by irradiation［J］.Polymer Degradation and Stability，2002，78（3）：533－538.

［3］李治，劉曉非，楊冬芝，等.殼聚糖降解研究進展［J］.化工進展，2006，19（6）：20－23.

［4］Xing R，Liu S，Yu H H，et al.Salt－assisted acid hydrolysis of chitosan to oligomers under microwave irradiation［J］.Carbonhydrate Research，2005，340（13）：2150－2153.

［5］Popa－Nita S，Lucas J M，Ladaviere C，et al.Mechanisms involved during the ultrasonically induced depolymerization of chitosan：Characterization and control［J］.Biomacromolecules，2009，10（5）：1203－1211.

［6］Rinaudo M，Domard A.Solution Properties of Chitosan［M］.New York：Elsevier Applied Science，1998：71－86.

［7］Muzzarelli R A A.Chitin and its derivatives：New trends of applied research［J］.Carbohyr Polym，1983，3（1）：53－75.

［8］Yalpani M.New Technologies for Healthy Foods and Nutraceuticals［M］.USA：ATL Press，1997：334.

［9］劉曉，石瑛，白雪芳，等.甲殼低聚糖的酸水解［J］.中國水產科學，2003，10（1）：69－72.

［10］Heggset E B，Hoell I A，Kristoffersen M，et al.Degradation of chitosans with chitinase G from streptomyces coelicolor A3（2）：Production of chito－oligosaccharides and insight into subsite specificities［J］.Biomacromolecules，2009，10（4）：892－899.

［11］Trombotto S，Ladaviere C，Delolme F，et al.Chemical preparation and structural characterization of a homogeneous series of chitin／chitosan oligomers［J］.Biomacromolecules，2008，9（7）：1731－1738.

［12］Tommeraas K，Varum K M，Christensen B E，et al.Preparation and characterisation of oligosaccharides produced by nitrous acid depolymerisation of chitosans［J］.Carbohydr Res，2001，333（2）：137－144.

［13］Chang K L B，Tai M C，Cheng F H.Kinetics and products of the degradation of chitosan by hydrogen peroxide［J］.J Agric Food Chem，2001，49（10）：4845－4851.

［14］王偉，薄淑琴，秦汶.不同脫乙酰度殼聚糖Mark－Houwink方程的訂定［J］.中國科學：B輯，1990，（11）：1126－1131.