葡聚糖的環氧化修飾與表征

楊梅竹，薛亞楠，蔡 寧，齊國斌，張 寒，喻發全

（武漢工程大學化工與制藥學院 綠色化工過程教育部重點實驗室，湖北 武漢430073）

葡聚糖與生物組織具有良好的生物相容性，無毒，對溫度和pH值的穩定性好［1］，經過化學改性后，可作為一種理想的藥物載體材料。葡聚糖的環氧化是在葡聚糖的結構單元中引入了環氧基團。環氧化葡聚糖由于引入了環氧基團，不僅水溶性得到提高，而且能夠很好地與帶有羥基（－OH）、氨基（－NH2）、羧基（－COOH）或巰基（－SH）官能團的藥物、蛋白質、DNA等［2－4］結合，形成具有特殊用途的藥物前驅體、藥物載體、基因載體等［2－6］。

作者在此以葡聚糖（Dex）為原料、1，4－丁二醇二縮水甘油醚（BDE）為雙端帶有環氧基團的環氧化試劑，在堿性條件下將葡聚糖分子鏈修飾上環氧基團，并考察了投料比、pH值、反應時間等條件對環氧取代度的影響；通過改變反應條件對環氧取代度進行調控，得到環氧取代度可調的環氧化葡聚糖，為葡聚糖進一步功能化修飾及應用奠定了基礎。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

葡聚糖（20kDa），分析純，阿拉丁試劑有限公司；1，4－丁二醇二縮水甘油醚，分析純，華威銳科試劑有限公司；氫氧化鈉（NaOH）、硼氫化鈉（NaBH4）、濃鹽酸（HCl）、五水合硫代硫酸鈉（Na2S3O3·5H2O）、酚酞，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；重水（D2O），青島騰龍微波科技有限公司。所有試劑均直接使用，未經純化處理。

透析袋（截留分子量Mw＝3500），上海晨易生物有限公司；Heal Force SUPER NW型系列超純水儀，力康科技有限公司。

1.2 環氧化葡聚糖的合成方法

按設定的反應條件，將一定量的葡聚糖溶解到0.6mol·L－1的NaOH溶液（含2mg·mL－1NaBH4）中，攪拌下將上述溶液經注射泵緩慢加入到過量的BDE溶液中，37℃下攪拌反應一定時間。反應結束后，將反應混合液轉入透析袋中，室溫透析3d，所得透析液經冷凍干燥后得到目標產物。反應式如圖1所示。

1.3 環氧化葡聚糖的結構表征

以重水（D2O）為溶劑，用Mercury VX－300型核磁共振波譜儀在300MHz下對環氧化葡聚糖進行核磁共振氫譜（1HNMR）的測定。

圖1 葡聚糖的環氧化反應Fig.1 Epoxidation of dextran

1.4 分析與檢測

1.4.1 環氧化葡聚糖分子量及其分布的測定

采用多角度激光光散射（MALLS）和尺寸排阻色譜（SEC）聯用分析系統（MALLS－SEC）測定環氧化葡聚糖的分子量及其分布。其中尺寸排阻色譜使用Waters－2690DHPLC裝備Ultrahydrogel 120和250柱，流動相為PBS緩沖溶液（0.5mol·L－1，pH值8.0），流速為0.6mL·min－1，柱溫為25℃。光散射數據由Wyatt DAWN DSP型多角度光散射檢測儀和Waters 2410型示差折光檢測器雙檢測系統獲得。

1.4.2 環氧化葡聚糖環氧取代度的測定

參照文獻［7］測定產物中環氧基團的含量，進而對葡聚糖的環氧取代度進行表征：

1.4.3 環氧化葡聚糖在水中穩定性的測定

將樣品配制成0.01mol·L－1的水溶液，4℃靜置，通過檢測環氧基團隨時間的變化情況考察其在水中的穩定性。

2 結果與討論

2.1 環氧化葡聚糖的結構表征

原料葡聚糖和產物環氧化葡聚糖的核磁共振氫譜見圖2。

圖2 葡聚糖（a）和環氧化葡聚糖（b）的核磁共振氫譜（D2O為溶劑）Fig.2 1 HNMR Spectra of dextran（a）and epoxy－activated dextran（b）using D2O as solvent

由圖2可以看出，3.4～4.0ppm處的4個峰（峰a～d）分別對應于葡聚糖骨架上的質子信號峰；而產物核磁譜圖中的3.2ppm（峰e）、2.8ppm（峰f）、2.6ppm（峰g）與1.5ppm（峰h）處則出現了不同于葡聚糖骨架的特征峰，它們分別歸屬于側鏈中與氧原子相連的亞甲基側鏈末端環氧基團中的次甲基與亞甲基以及側鏈中亞甲基的質子信號峰。表明環氧基團被成功地引入到葡聚糖的側鏈中，并且由于BDE側鏈的引入使3.4ppm（峰d）處信號峰強度增強。通過計算側鏈末端環氧基團中的特征信號峰（峰g或f）與葡聚糖骨架單元中特征信號峰（峰a或b）的積分面積比可以得到產物的環氧取代度。同時，由于交聯副產物的生成，使得峰h的積分面積增大。通過計算產物中峰h與峰g或f的積分面積比可以得到產物中交聯產物的比例。結果發現，該產物中約有25%交聯副產物，使得側鏈的有效環氧化率有所降低。

2.2 環氧化葡聚糖的分子量及其分布（表1）

表1 葡聚糖和環氧化葡聚糖的分子量及其分布Tab.1 Molecular weight and its distribution of dextran and epoxy－activated dextran

由表1可以看出，由于側鏈基團的引入，產物環氧化葡聚糖的分子量相對于原料葡聚糖而言有所增加，分子量分布寬度也有所變大；且對應的GPC淋出曲線均呈單峰分布（圖略），證明所得產物中沒有產生大的交聯物。

2.3 反應條件對環氧取代度的影響

2.3.1 投料比（Dex與BDE的摩爾比，下同）對環氧取代度的影響

在堿性條件下，醇羥基引發BDE上的環氧基團發生開環反應；再將活性環氧基團引入到葡聚糖的側鏈中，得到環氧化葡聚糖。通過采用過量BDE的方法，減少交聯葡聚糖副產物的生成。

在37℃、不同pH值條件下反應4h得到的環氧化葡聚糖的環氧取代度隨投料比的變化見圖3。

圖3 不同pH值條件下，投料比對環氧取代度的影響Fig.3 Effect of molar ratio of Dex to BDE on epoxy degree at different pH values

由圖3可以看出，隨著BDE用量的增加，產物的環氧取代度明顯升高。這是因為，BDE兩端各帶有一個環氧基團，為保證葡聚糖側鏈上引入環氧基團，BDE上只能有一端環氧基團參加反應，因此，BDE的用量要過量。當BDE用量較少時，兩端環氧基團均參加反應的幾率增大，從而使交聯副產物的比例提高，環氧化目標產物的量相應減少；增加BDE用量，反應體系中環氧基團過量程度提高，交聯反應的幾率就會減小，環氧取代度相應升高。因此，通過增加BDE的用量，可以有效提高產物的環氧取代度，降低交聯幾率。綜合考慮，確定適宜的投料比n（Dex）∶n（BDE）為1∶30。

2.3.2 pH值對環氧取代度的影響

在37℃、投料比n（Dex）∶n（BDE）＝1∶30的條件下，反應4h得到的環氧化葡聚糖的環氧取代度隨pH值的變化見圖4。

圖4 pH值對環氧取代度的影響Fig.4 Effect of pH value on epoxy degree

由圖4可以看出，環氧取代度隨pH值的增大先升高后降低；在pH值為12.6～12.7時，環氧取代度達到最高。這是因為，增大pH值，有利于誘導環氧基的開環，與葡聚糖的反應變得容易，環氧取代度相應升高；但進一步增大pH值，可使剩余的環氧基團相繼開環，甚至可進一步誘導葡聚糖間的交聯，反而導致環氧取代度降低。因此，確定適宜的pH值為12.6。

2.3.3 反應時間對環氧取代度的影響

在37℃、n（Dex）∶n（BDE）＝1∶30、pH值為12.6的條件下，反應不同時間（2～48h）得到的環氧化葡聚糖的環氧取代度見圖5。

圖5 反應時間對環氧取代度的影響Fig.5 Effect of reaction time on epoxy degree

由圖5可以看出，環氧取代度隨反應時間的延長先升高后降低；在反應12h時，環氧取代度達到最高；12h以后，由于反應基本完成，隨反應時間的繼續延長，產物側鏈中的環氧基團發生進一步開環反應，使交聯反應的幾率增大，從而導致環氧化目標產物不斷減少，環氧取代度相應降低。因此，確定適宜的反應時間為12h。

2.4 環氧化葡聚糖在水中的穩定性（圖6）

圖6 環氧化葡聚糖在4℃水中的穩定性Fig.6 The stability of epoxy－activated dextran in water at 4℃

由圖6可以看出，30d內環氧化葡聚糖中環氧基團的含量基本保持不變，說明低溫下（4℃）環氧化葡聚糖在水中的穩定性良好。

3 結論

以葡聚糖（Dex）為原料、1，4－丁二醇二縮水甘油醚（BDE）為環氧化試劑，在堿性條件下，通過BDE的開環反應得到環氧基團修飾的環氧化葡聚糖，并且通過改變反應條件可得到取代度可控、穩定的環氧化葡聚糖，在37℃、投料比n（Dex）∶n（BDE）＝1∶30、pH＝12.6、反應時間為12h的條件下，環氧取代度高達16%，且4℃的低溫下環氧化葡聚糖在水中的穩定性良好。

［1］羅成果.改性葡聚糖和蛋白質作為高分子功能材料的研究［D］.鄭州：鄭州大學，2006.

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［3］Torres P，Batista－Viera F.Improved biocatalysts based on Bacillus circulansβ－galactosidase immobilized onto epoxy－activated acrylic supports：Applications in whey processing［J］.Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2012，83：57－64.

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