深海枝芽胞桿菌A493產生的新活性物質Z11的抗菌機理

黃 典，陳 莉，邵宗澤，孫風琴，張少博，林 達，張鼎楠，喻子牛，張吉斌

（1.華中農業(yè)大學 農業(yè)微生物學國家重點實驗室 生命科學技術學院 微生物農藥國家工程研究中心，湖北 武漢430070；2.國家海洋局第三海洋研究所 海洋生物遺傳資源重點實驗室，福建 廈門361005）

細菌病害是一類重要的植物病害，每年都造成重大的農作物產量和經濟損失。目前，防治植物細菌病害主要以化學防治為主、生物防治為輔，但由于農業(yè)生產過程中化學農藥的過量使用，其產生的各種問題諸如對環(huán)境、人類健康和非靶標生物的危害等，使得化學防治受到很大的限制［1，2］。因此，植物細菌病害的生物防治越來越受到人們的關注［3－6］。目前國內外主要利用陸地微生物來進行植物細菌病害的防治工作，利用海洋微生物的相關報道不多。

研究者從深海分離得到一株枝芽胞桿菌（Virgibacillus dokdonensis）A493，其產生的新活性物質Z11經初步鑒定為新型的氨基糖苷類化合物，對植物細菌水稻黃單胞菌有較強拮抗效果。作者在此以水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）為研究對象，研究新活性物質Z11對水稻黃單胞菌生理、生化方面的影響，了解其抗菌機理，擬為生物農藥的開發(fā)奠定理論基礎。

1 實驗

1.1 菌種來源

水稻黃單胞菌，由華中農業(yè)大學農業(yè)微生物學國家重點實驗室菌種保藏中心（CCAM）提供；深海枝芽胞桿菌A493（MCCC1A00493），由國家海洋局第三海洋研究所海洋生物遺傳資源重點實驗室邵宗澤研究員鑒定并提供。

1.2 培養(yǎng)基

海洋細菌培養(yǎng)基（2216E）：蛋白胨10g，酵母粉5g，牛肉浸粉1g，乙酸鈉1g，硝酸銨0.2g，檸檬酸鈉0.5g，檸檬酸鐵0.1g，人工海水定容至1L，終pH＝7.6±0.2。

人工海水配方：氯化鈉19.45g，氯化鎂0.75g，硫酸鎂0.75g，氯化鈣1g，氯化鉀0.55g，碳酸氫鈉0.16g，溴化鉀0.08g，氯化鍶34mg，硼酸22mg，硅酸鈉4mg，氟化鈉2.4mg，磷酸氫二鈉8mg，氯化錳0.5mg，硫酸銅0.5mg，硫酸鋅10mg，純水定容至1L。

水稻黃單胞菌培養(yǎng)基（協(xié)本氏培養(yǎng)基PSA）：馬鈴薯300g，蔗糖15g，十二水合磷酸氫二鈉2g，四水合硝酸鈣0.5g，蛋白胨5.0g，蒸餾水1L。相應固體培養(yǎng)基按1.5%～2.5%瓊脂粉配制。

1.3 儀器

高速離心機，超凈工作臺，恒溫搖床，冷凍離心機，超聲破碎儀，紫外分光光度計，DU730型核酸蛋白分析儀，DDS－801A型電導儀，Waters高效液相色譜儀，C18色譜柱（4.6mm×250mm），50μL進樣針。

1.4 方法

1.4.1 活性物質Z11對水稻黃單胞菌生長的影響

取處于對數(shù)生長期的水稻黃單胞菌細胞，按1%接種量接種于5mL PA瓶中，設置7個濃度梯度，分別加入活性物質Z11 0μL、5μL、10μL、20μL、40μL、80μL、160μL，終濃度（μg·mL－1）分別為0、14、28、56、112、224、448；于28℃、180r·min－1恒溫振蕩培養(yǎng)24h；再于4℃、8000r·min－1離心30min，收集沉淀；用生理鹽水洗滌3次后，離心，將沉淀用等體積生理鹽水懸浮，測定其OD600值。檢測不同濃度活性物質Z11作用下的水稻黃單胞菌生長情況。

1.4.2 活性物質Z11對水稻黃單胞菌蛋白質合成的影響

取處于對數(shù)生長期的水稻黃單胞菌細胞，按1%接種量接種于5mL PA瓶中，設置5個濃度梯度，分別加入活性物質Z11 0μL、5μL、10μL、20μL、40 μL，終濃度（μg·mL－1）分別為0、14、28、56、112；于28℃、180r·min－1恒溫振蕩培養(yǎng)24h；再于4℃、8000r·min－1離心30min，收集沉淀；用生理鹽水洗滌3次后，離心，將沉淀用等體積生理鹽水懸浮，測定其OD600值；取1.5mL菌懸液經冰浴超聲波（300W）破碎菌體（3min，每次3s，間隔3s），于3000r·min－1離心30min；取上清液在核酸蛋白分析儀上測定280nm和260nm處的吸光度。按下式計算蛋白質濃度：

蛋白質濃度（mg·mL－1）＝1.45OD280－0.74OD260（1）

1.4.3 活性物質Z11對水稻黃單胞菌細胞膜通透性的影響

取對數(shù)生長期細胞培養(yǎng)液2mL，于8000r·min－1、4℃離心30min，收集沉淀，用ddH2O洗滌沉淀3次，再用0.9%NaCl懸浮至5mL，分別加入活性物質Z11 0μL、5μL、10μL、20μL，終濃度（μg·mL－1）分別為0、14、28、56，充分搖勻，作用0min、30min、60 min、90min、120min、150min后測定其電導率。

1.4.4 活性物質Z11對水稻黃單胞菌細胞壁合成關鍵酶的影響

以尿苷三磷酸（UTP）和N－乙酰葡糖胺－1－磷酸（GlcNAc－1－P）為反應底物，在水稻黃單胞菌細胞壁合成關鍵酶N－乙酰葡糖胺－1－磷酸尿苷酰轉移酶（GlmU）的催化作用下生成尿苷二磷酸－N－乙酰葡糖胺（UDP－GlcNAc），通過HPLC檢測活性物質Z11加入前后反應的產物量即可計算酶活抑制率，以反映活性物質Z11對GlmU酶的抑制效果。

反應體系：15μL Buffer（50mmol·L－1Tris－HCl、10mmol·L－1MgCl2、1mmol·L－1DTT）、10μL 2mmol·L－1UTP和10μL 2mmol·L－1GlcNAc－1－P作為反應底物、2μL活性物質Z11作為抑制劑、5μL GlmU酶最后加入。在37℃反應10min后，于沸水中煮10min終止反應；然后于12 000r·min－1離心5min；反應混合物以20mmol·L－1、pH值為5.0的三乙胺醋酸（TEAA）＋0.35%甲醇為流動相，流速1mL·min－1，室溫下分離底物和產物，檢測波長為254nm，進樣量為20μL。實驗重復3次，記錄HPLC譜圖中產物峰面積，按下式計算酶活抑制率：

式中：S0、S1分別為加入活性物質Z11前后產物的峰面積。

2 結果與討論

2.1 活性物質Z11對水稻黃單胞菌生長的影響（表1）

表1 活性物質Z11對水稻黃單胞菌生長的影響Tab.1 The effect of active substance Z11on growth of X.oryzae pv.oryzae

由表1可看出，在不同濃度活性物質Z11作用下，菌體OD600值之間存在顯著差異，說明活性物質Z11能夠顯著影響水稻黃單胞菌的生長。一定濃度范圍內，隨著活性物質Z11濃度的增大，OD600值減小，菌體濃度降低，菌體生長受到抑制；當活性物質Z11濃度達到56μg·mL－1之后，可以直接殺死水稻黃單胞菌。

2.2 活性物質Z11對水稻黃單胞菌蛋白質合成的影響（表2）

表2 活性物質Z11對水稻黃單胞菌蛋白質合成的影響Tab.2 The effect of active substance Z11on protein synthesis of X.oryzae pv.oryzae

由表2可看出，在不同濃度活性物質Z11作用下，菌體蛋白質濃度之間存在顯著差異，說明活性物質Z11能夠影響水稻黃單胞菌蛋白質的合成。在抑制菌體生長的濃度范圍內，隨著活性物質Z11濃度的增大，蛋白質濃度不斷減小，當活性物質Z11濃度超過56μg·mL－1后，蛋白質的合成幾乎停止。

2.3 活性物質Z11對水稻黃單胞菌細胞膜通透性的影響（表3）

表3 活性物質Z11對水稻黃單胞菌細胞膜通透性的影響Tab.3 The effect of active substance Z11on cell membrane permeability of X.oryzae pv.oryzae

由表3可知，在不同濃度活性物質Z11作用下，隨著處理時間的延長，電導率的變化趨勢一致，菌體電導率值之間沒有顯著性差異。說明活性物質Z11對水稻黃單胞菌細胞膜通透性沒有影響。

2.4 活性物質Z11對水稻黃單胞菌細胞壁合成關鍵酶的影響

催化反應底物和產物的高效液相色譜見圖1。

圖1 催化反應底物和產物的高效液相色譜Fig.1 The HPLC spectrum of substrate and product in the catalytic reaction

由圖1數(shù)據(jù)計算，加入活性物質Z11前后產物的峰面積分別為928386.7±32046.7、744613.3±34679.1，活性物質Z11對GlmU酶的抑制率為（19.74±3.55）%。表明活性物質Z11對GlmU酶存在一定抑制效果，GlmU酶蛋白可能為潛在靶標之一。

2.5 討論

深海枝芽胞桿菌A493所產抗菌活性物質Z11為一種新型的氨基糖苷類活性物質，前期研究顯示活性物質Z11耐酸堿、耐高溫、性質穩(wěn)定、抗菌譜窄，推測其抗菌機理具有特異性，本研究結果顯示新活性物質Z11并不改變病原菌細胞膜的通透性能，但是能夠明顯影響病原菌蛋白質的合成，可能在病原菌核糖體內存在其相應的作用靶標。

肽聚糖是細菌細胞壁的主要組成部分，如果肽聚糖的生物合成受阻，細菌細胞壁的合成必定會受到影響。UDP－GlcNAc作為肽聚糖和脂多糖生物合成的一種必需的細胞質前體［7－9］，是細菌細胞壁合成所必需的。GlmU酶具有乙酰基轉移酶活性和尿嘧啶轉移酶活性，是UDP－GlcNAc生物合成途徑中的關鍵酶，GlmU酶受到抑制將直接導致細菌細胞壁合成受阻而死亡［10］，HPLC法測定水稻黃單胞菌GlmU酶活性是根據(jù)核苷酸糖類在254nm處有特征吸收峰，而且不同的核苷酸糖在以三乙胺醋酸為流動相時的保留時間不同而成功分離底物GlcNAc－1－P、UTP以及產物UDPGlcNAc［11］，為水稻黃單胞菌中潛在靶標蛋白的尋找和驗證提供了一種準確、簡單、可行的方法。

3 結論

以一株抗菌譜窄的深海枝芽胞桿菌（Virgibacillus dokdonensis）A493為研究對象，對其產生的新的氨基糖苷類抗菌活性物質Z11抑制水稻黃單胞菌的濃度范圍和抗菌作用機理進行了研究。結果表明：Z11抑制水稻黃單胞菌的濃度范圍為14～56μg·mL－1；活性物質Z11不改變水稻黃單胞菌細胞膜通透性，但能影響其蛋白質的合成和細胞壁合成關鍵酶N－乙酰葡糖胺－1－磷酸尿苷酰轉移酶（GlmU）的活性，從而影響其細胞壁的合成及其完整性。研究結果說明活性物質Z11對水稻黃單胞菌的作用機制是多方面的，但是，明確其抗菌分子機制還需要進一步深入研究。

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