趨化因子受體CXCR4拮抗劑AMD3100的合成及99Tcm標記

桂 媛，徐志宏，張曉軍，張書文，劉 健，田嘉禾，張錦明

(1.江蘇華益科技有限公司，江蘇 常熟 215522；2.中國人民解放軍總醫院 核醫學科 北京 100853 )

趨化因子受體CXCR4是一個由352個氨基酸構成的G蛋白耦聯受體，目前已經發現CXCR4在20多種不同類型腫瘤中表達，包括膠質瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌、直腸癌、黑色素瘤等，表達程度與腫瘤的惡性程度、進展程度相關，特別是在轉移癌中高表達，預示腫瘤細胞的轉移能力[1-2]。1,1'- [1,4-亞苯基二(亞甲基)]-二-1,4,8,11-四氮雜環十四烷(AMD3100)是強效、選擇性非肽類趨化因子CXCR4受體拮抗劑，通過與CXCR4受體結合而抑制SDF-1誘導的癌細胞的黏附、遷移、增殖等生物學特性。作為一種新型的受體阻斷劑AMD3100能與SDF-1 競爭結合CXCR4，已被證實能抑制大多數惡性腫瘤，對惡性腫瘤起治療作用[3-4]。于亮[5]等發現在1 g/L水平AMD3100對結腸癌細胞SW480的抑制率達到77.2%(P<0.01), 同時AMD3100作為抗AIDS、抗腫瘤、骨髓移植的研發藥已進入III期臨床階段。文獻研究表明，金屬離子Cu2+、Zn2+或Ni2+等與AMD3100絡合后占據了銅上六個配合位點中的四個配位點。而CXCR4上VI區Asp262和VII區Glu288各有一個羧基殘基與銅上剩余的二個位點進一步絡合，形成六配位穩定化合物，從而提高了AMD3100與CXCR4的親合力[6-7]。已有報道采用放射性64Cu標記AMD3100，并證實了64Cu-AMD3100在肝中高攝取[8-9]。99Tcm是核醫學最常用的核素，采用99Tcm標記的小分子常用于腫瘤顯像和腦顯像[10-12]。本研究小組曾采用99Tcm直接法標記AMD3100，得到的標記物99Tcm-AMD3100在Hep-G2移植肝癌上有明顯的攝取[13]，優化標記條件并證實腫瘤攝99Tcm-AMD3100[14]。本研究以N,N-二(3-氨丙基)乙基乙胺為原料，經改良法合成AMD3100，并用放射性金屬核素99Tcm標記，研究其在正常NH小鼠體內生物分布及荷Hep-G2肝癌小鼠SPECT顯像。

1 實驗材料

1.1 試劑和儀器

N,N-二(3-氨丙基)乙基乙胺、1,4,二芐溴、甲苯磺酰氯、(CH2OTs)2、無水SnCl2：分析純，美國Sigma公司；99TcmO4-：北京原子高科股份有限公司；其余試劑為北京化學試劑公司。

BioScan-3000放射性薄層掃描儀：美國BioScan公司。

1.2 實驗動物

NH小鼠：20只，體重(20±2)g，均為雄性，解放軍總醫院動物實驗中心提供。

2 實驗方法

AMD3100合成線路圖示于圖1。

圖1 AMD3100合成線路圖Fig.1 Scheme of synthetic route of AMD3100

2.1 AMD3100的合成

(1)250 mL三口燒瓶，加入N,N-二(3-氨丙基)乙基乙胺 5.2 g，10%的NaOH溶液50 mL，攪拌冷卻至0 ℃，慢慢滴加對甲苯磺酰氯25.0 g的THF 100 mL溶液，滴加完畢，室溫攪拌過夜，反應結束。抽濾，洗滌，干燥得產物1， 共19.2 g，產率為80%。MS:791(M+H)+，1H NMR(CDCl3): 1.76～1.81(m，4H，βH)，1.86(s，2H，NH)，2.40～2.42(two s，12H，-NSO2C6H4CH3)，3.0(m，12H，αH)， 7.20～7.80(m，16H，aromatic)，鑒定為目標產物。

(2)250 mL三口燒瓶(氮氣保護)，加入30.0 g產物1 ，DMF 100 mL，室溫攪拌，分批加入NaH 5.00 g，攪拌2～3 h，抽濾，濾液倒入500 mL三口燒瓶中(氮氣保護)，加熱至120 ℃，緩慢滴加乙二醇對甲基苯磺酸酯 12.0 g的DMF 50 mL，滴加完畢反應3 h，反應結束。旋掉大部分DMF，直到有大量固體析出，加水攪拌，抽濾，干燥得產物2共 13.0 g，產率為50%。MS:817(M+H)+，1H NMR(CDCl3): 1.76～1.81(m，4H,βH)，2.47(s，12H，-NSO2C6H4CH3), 3.22(m，16H，αH)， 7.21～7.80(m，16H，aromatic)，鑒定為目標產物。

(3)1 000 mL三口燒瓶中，加入10.0 g產品2 ，氫溴酸 90 mL，乙酸 165 mL，加熱回流48 h，反應結束，抽濾，放于5 ℃冰箱析晶，抽濾，濾餅用盡量少的去離子水溶解，用50%的NaOH溶液調節pH到強堿性，用CH2Cl2萃取，合并有機相，無水MgSO4干燥，抽濾，旋干，得產物3 共3.0 g，產率為36%。MS:201(M+H)+，1H NMR(CDCl3): 1.72～1.81(m，4H，βH)，2.59(s，4H，NH)，2.72(s，8H，αH)， 2.75～2.80(m，8H，αH)，鑒定為目標產物。

(4)裝置氮氣保護，1 g四氮十四環溶于125 mL二氯甲烷中，冷至0 ℃以下，緩慢滴加2 g(Boc)2O(1.8 eq)，約20 min滴完，滴加完畢后在室溫下反應4 h。旋干反應液，過柱分離可得產品4。分離液為V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=1∶99，經過柱分離可得產物4 共1.5 g，產率60%。MS:501(M+H)+，1H NMR(CDCl3): 1.37(s,27H, t-Bu), 1.60～1.64(m，2H)， 1.85～1.95(m，2H)， 2.50～2.55(t，2H)， 2.70～2.74( t，2H)，3.21-3.33(m，12H)，鑒定為目標產物。

(5)裝置氮氣保護，依次加入2 mmol中間體4， 1 mmol對二溴芐氯，0.414 g無水碳酸鉀，15 mL乙腈，回流反應過夜。冷至室溫，旋干濾液，殘留物用乙酸乙酯溶解，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥，過濾，旋干得粗產品。取1 g粗產品, 直接加入10 mL濃鹽酸，室溫反應過夜。旋干反應液，可得白色固體，該固體用NH3與甲醇溶液調成堿性，過濾即得所需的AMD3100, 約0.8 g，產率72.1%。MS:503(M+H)+，1H NMR(D2O): 2.00～2.20(br，8H), 3.40～3.46(m,16H), 3.50～3.55(m，16H)，4.48(s,4H), 7.60～7.64( m，4H)，鑒定為目標產物。

以N,N-二(3-氨丙基)乙基乙胺為原料，合成AMD3100總的合成效率為5.8%。

2.2 99Tcm-AMD3100的制備[13]

采用直接標記法，用亞錫將99TcmO4-還原后直接與AMD3100絡合。0.8 mg前體AMD3100溶于0.5 mL注射水，用磷酸緩沖溶液將pH調為9，加入200 μL 1 g/L SnCl2和370 MBq (10 mCi)99TcmO4-，于室溫反應10 min。采用紙色層法測定標記物標記率。

2.3 99Tcm-AMD3100在正常NH小鼠體內生物分布

NH小鼠20只，隨機分成5組，每組4只，尾靜脈注射經生理鹽水稀釋的99Tcm-AMD3100, 每只1.85 MBq每0.2 mL。注射后于不同時相處死,取血、心、肝、脾、肺、腎和肌肉，分別測量放射性計數并稱重，計算放射性攝取率(%ID/g)。

2.4 荷Hep-G2肝腫瘤小鼠顯像

取正常傳代培養的Hep-G2肝癌細胞株，從培養瓶中吹下，制成細胞懸液，濃度為2×105/mL，取0.2 mL接種于裸鼠右上肢皮下，接種后6～7 d，腫瘤直徑為1.0～1.2 cm備用。尾靜脈注射生理鹽水稀釋的99Tcm-AMD3100，每只3.7 MBq每0.2 mL，于注射后60 min置于針孔準直器下顯像。

3 結果與討論

3.1 AMD3100的合成

文獻[8]一般以1，4，8，11-四氮雜環十四烷(3)為原料，合成AMD3100，但化合物3的價格昂貴，且不易制備。本研究以文獻[15]為基礎，并改進了合成條件。化合物1到2的關環，文獻采用碳酸銫，蘇靖等[16]采用無水碳酸鉀。實驗中發現無水碳酸鉀關環效果不理想，本研究采用了堿性更強的NaH，合成效率達60%。化合物3上氮原子保護，一般采用對甲苯磺酰氯，為了防止過度反應或反應不完全，采用二步滴加對甲苯磺酰氯，操作較麻煩。本研究采用二碳酸二叔丁酯保護，可以一步完成，但需嚴格控制反應物比例。采用鹽酸水解，室溫下即可水解得到最終產品,較乙酸的水解反應溫和。

3.2 99Tcm-AMD3100的制備[13]

紙色層法測定99Tcm-AMD3100標記率大于98%，未見有水解的锝。文獻[14]系統報道了99Tcm直接標記AMD3100的最佳條件，認為pH能明顯影響標記率，在pH達到11時標記率為26%。本研究的pH在7到9之間，未發現標記率下降。

3.3 99Tcm-AMD3100在正常NH小鼠體內的生物分布

99Tcm-AMD3100在正常NH小鼠體內的生物分布列于表1。由表1可見，99Tcm-AMD3100注射正常NH小鼠后，標記物主要分布于肝臟，該結果與64Cu-AMD3100分布一致[8]。在2 h，放射性主要集中于肝、脾和腎。肝內CXCR4有高表達，因此，肝臟攝取99Tcm-AMD3100較高，肌肉和心肌攝取量較低，血液中清除較快，該結果與文獻[14]報道結果一致。

表1 99Tcm-AMD3100在正常NH小鼠體內的生物分布

3.4 99Tcm-AMD3100在荷Hep-G2肝腫瘤小鼠顯像

荷Hep-G2腫瘤鼠尾靜脈注射99Tcm-AMD3100后1 h顯像，見上肢部腫瘤顯像明顯，經ROI法測量其攝取與對側肌肉比為3.2∶1，其余器官如大腦、肺等均沒有明顯攝取。由于顯像視野受限，沒有觀察到肝的顯像，但在頭部口腔位置有較高的放射性濃集，原因不詳。Hep-G2是一株高表達CXCR4的肝癌細胞，因此該腫瘤能明顯攝取99Tcm-AMD3100。

文獻[14]采用PC-3腫瘤顯像，腫瘤顯像結果不理想。但阻斷(20 mg/Kg)后發現腫瘤放射性攝取下降，說明腫瘤攝取放射性與AMD3100相關。因此，下一步應測量阻斷前后肝腫瘤攝放射性的變化及動力學，進一步證明肝腫瘤攝99Tcm-AMD3100與CXCR4相關。

圖2 99Tcm-AMD3100在荷Hep-G2肝腫瘤小鼠SPECT顯像Fig.2 CXCR4 imaging in Hep-G2 xenografts bearing tumor with 99Tcm-AMD3100

4 結論

以N,N-二(3-氨丙基)乙基乙胺為原料合成了AMD3100, 采用金屬核素99Tcm標記AMD3100的標記率大于98%，小鼠體內生物分布表明，99Tcm-AMD3100主要分布于肝、脾和腎，SPECT顯像結果表明，荷Hep-G2肝癌小鼠攝取99Tcm-AMD3100明顯。合成AMD3100的工藝簡單，產品可以直接用于CXCR4受體拮抗劑，99Tcm-AMD3100具有潛在腫瘤CXCR4表達顯像劑價值。

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