急性肺損傷實驗動物模型

陳 勇，周繼紅，歐陽瑤

急性肺損傷(ALI)和其更嚴重階段的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是由心源性以外的各種肺內外致病因素所導致的急性缺氧性呼吸衰竭，由于其造成了較大的臨床壓力和沉重的社會經濟負擔［1－2］，近些年來對ALI/ARDS實驗動物模型的研究也越來越多。本文就近年來急性肺損傷實驗動物模型研究進展作一綜述。

1 如何建立理想的模型

理想的肺損傷實驗動物模型應該復制人類肺損傷的發生機制和后果，這其中主要包括病理和生理學上的變化。但是，目前為止沒有任何一個實驗動物模型可以完全復制人類急性肺損傷的所有特征，大多肺損傷實驗動物模型只是針對人類肺損傷的單個或少數幾個病理生理特征進行復制，如換氣功能異常、肺順應性下降、肺實質損傷和肺泡毛細血管膜通透性增加等。正是因為人類肺損傷疾病本身的復雜性和多樣性，才使得急性肺損傷模型的建立方式和推論層出不窮，至今沒有公認的建模標準。

1．1 實驗動物肺損傷和人類肺損傷的不同 動物和人類在解剖學上和生理學上有許多不同。例如，小鼠的呼吸頻率(250～300次/min)遠高于人類呼吸頻率(12～16次/min);相比于人，小鼠和大鼠的肺部肺泡較少且血氣屏障較薄;小鼠只有6～8級支氣管分支，而人類卻有20級或更多;小鼠的終末端細支氣管注入肺泡管和肺泡，而人類呼吸性細支氣管注入肺泡管和肺泡;鼠科類動物氣道遠端比人類氣道遠端有更多的Clara細胞和大量的支氣管淋巴樣組織等。值得注意的是，鼠科類動物急性肺損傷時肺部病理很少出現典型的透明膜現象。另一個容易忽略的是人與動物之間的生活環境的不同。大多動物都是被飼養在高度控制的環境中，這使得動物接觸到外界的病菌很有限，由此人或實驗動物急性肺損傷時，固有免疫系統對各自肺病理形態發展和變化的影響會出現差異。

1．2 實驗動物的大小 進行急性肺損傷建模時，實驗動物的體型也是選擇實驗動物必須要考慮的因素。研究由膿毒癥引起的ALI/ARDS治療方案時，較小體型動物，如鼠科類，難以出現理想實驗結果的一個重要原因就是未能在實驗過程中正確地實施機械通氣，因為給體型較小的動物實施肺通氣較困難;相反，對體型較大的膿毒癥引起的肺損傷實驗動物實施機械通氣較易，這一類型動物膿毒癥致傷后的病理生理改變也更接近人類，缺點是體型較大的動物價格昂貴［3］。血液的采集也會因動物體型大小有差異。從較大體型動物，如兔、綿羊、犬類和非人類靈長類動物身上獲取血液標更容易本且標本量更充足。需要研究監控生理指標時，如進行多時間段的血氣分析、血漿中細胞因子水平檢測和白細胞計數，血液標本量是否充足就尤為關鍵。

1．3 肺損傷實驗動物模型的評估

1．3．1 急性肺損傷動物實驗模型病理生理變化觀察時間點的選取 ALI/ARDS的臨床征象是呼吸困難、非心源性水腫、肺順應性下降和胸部X線診斷兩肺出現彌漫性浸潤陰影。以上征象進展迅速，常常在初始致傷后24～48h出現［4－5］;ALI/ARDS病人肺損傷后病理變化主要由3個相互重疊的階段組成:滲出期、增殖期和纖維化期。初始致傷后12～24h內是滲出期，這一時期可能持續7d［6］。這一階段特征是急性炎癥反應，會釋放大量促炎和抗炎細胞因子，緊接著中性粒細胞在肺部大量聚集。第二個階段是增殖期，這一階段一般在致傷后第3d開始并持續2周［6］。這一時期Ⅱ型肺泡上皮細胞增殖并取代Ⅰ型肺泡上皮細胞，成纖維細胞浸潤肺泡腔。ALI/ARDS最后一階段纖維化期，這一時期在傷后持續5～28d，此期屬于修復階段。由于病人間個體差異，不是所有ALI/ARDS病人都會出現以上特征。

罹患ALI/ARDS的病人其生理和病理變化伴隨時間的發展是難以監測的。相反，肺損傷動物實驗是在高度控制的條件下進行，在不同的時間點動物的生理和病理變化情況較易獲得。但是，急性肺損傷實驗動物造模的時間點最好限制在24h以內，因為此階段是肺損傷發生炎癥的高峰期［7－8］，而在之后大多數急性肺損傷動物模型通常肺部炎癥基本消退，Rojas等［9］在其內毒素致小鼠肺損傷實驗中，發現內毒素注入24h內血清中大多數細胞因子濃度水平升高，之后緩慢下降，而48h后，病理結果顯示肺部炎癥消退。

1．3．2 影像學檢查評估 臨床工作中，影像學檢查是確診ALI/ARDS一項重要指標，典型的影像學診斷是雙肺出現彌漫性浸潤陰影。急性肺損傷動物實驗研究中，所采用的影像學檢查主要是X線和CT。但是實驗動物的大小和實驗室設備上的限制在一定程度上阻礙了影像學診斷在實驗動物中的研究，尤其是CT檢測成本較高。影像學檢查較適用于體格較大的動物，如兔、狗、綿羊和豬等動物。

1．3．3 組織學評估 Matute-Bello等在 2008年［10］和2011［7］年發表的文章中認為，為了復制出更接近ALI/ARDS病人病理生理特征，急性肺損傷實驗動物模型應該復制出急性肺損傷時肺上皮細胞和內皮細胞病理變化特征，并且肺部應該有炎癥表現發表的文章中認為，為了復制出更接近ALI/ARDS病人病理生理特征，急性肺損傷實驗動物模型應該復制出急性肺損傷時肺上皮細胞和內皮細胞病理變化特征，并且肺部應該有炎癥表現。筆者認為如何從病理學上復制出更接近ALI/ARDS病人肺部改變，應該根據實驗研究的具體方向和實驗研究的目的進行選擇，幾種常見的急性肺損傷模型肺部組織病理變化見(表1)。

表1 常見肺損傷實驗動物模型病理表現

1．3．4 生理學評估 急性肺損傷病人主要生理特征是通氣/血流比值異常、嚴重的血氧不足、肺順應性下降和肺泡液清除功能受損。急性肺損傷實驗動物模型會因為動物類別、致傷方式、觀察時間和實驗操作等因素產生不同的生理改變。

低氧血癥是評估急性肺損傷實驗動物建模合理的一個重要指標，由于急性肺損傷實驗動物建模并沒有公認的標準，所以以前不少研究者建模時參考1994年歐美聯盟協會根據臨床病例統計分析提出的ALI/ARDS診斷標準［19］，但Matute-Bello等［7］認為這一標準直接應用于判斷急性肺損傷實驗動物傷情并不合理，它只能在一定程度上反映出實驗動物肺損傷的程度。筆者認為目前尚未有評估急性肺損傷實驗動物建模公認的標準，而動物實驗的目的是最大可能復制臨床疾病的各種特征并據此進行干預實驗服務于臨床，所以將臨床所采用的診斷標準應用于評價實驗動物模型造模還是有一定價值的。

肺順應性下降是ALI/ARDS的另一個顯著特征，這一特征主要是由于肺水腫和肺不張引起，在實驗動物模型中這一指標較易監測。主要評價的指標包括呼吸節律、氣道峰壓、平均氣道壓、氣道平臺壓、潮氣量、呼氣末正壓、每分鐘呼氣量和肺靜態順應性。雖然這一評估方式比較有效，但是其成本不僅昂貴，而且僅通常對體格較大的實驗動物檢測才有較為理想的結果。

1．3．5 急性肺損傷炎性反應 理想的急性肺損傷炎癥反應指標應該與肺病理生理變化緊密相互聯系。這些指標應該可靠、易復制、檢測方法簡便經濟且特異性強。急性肺損傷實驗動物常用檢測炎癥反應的標本有支氣管肺泡灌洗液(bronchocalveolar lavage fluid，BALF)、肺水腫液、肺組織勻漿液和血清。所有指標中研究較多，同時也被認為是評估急性肺損傷程度較為重要的是支氣管肺泡灌洗液中的中性粒細胞數量、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)濃度和肺損傷時肺部釋放到BALF中的炎性細胞因子濃度。盡管急性肺損傷時肺泡腔中炎性因子表達顯著，但是目前臨床上對ALI/ARDS病人抗炎治療收效甚微。

2 幾種肺損傷實驗動物模型

急性肺損傷實驗動物建模方式有很多種，致傷因素的不同所產生的肺損傷病理生理表現也有所不同，因為篇幅所限本文就不一一介紹了，僅簡要介紹實驗室中幾種常見的急性肺損傷實驗動物模型。

2．1 內毒素致急性肺損傷模型 內毒素致傷模型多采用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，通過吸入、靜脈注射或腹腔注射入實驗動物。LPS是革蘭陰性細菌，細胞膜表面的主要結構，由三部分共價連接而成，即O特異性抗原多糖、核心多糖及脂質A。內毒素注入實驗動物后，實驗動物處于全身炎癥反應狀態，表現為全身炎癥反應綜合征(SIRS)，刺激機體釋放炎性細胞因子，從而引起瀑布樣級聯反應，使肺泡上皮細胞及血管內皮細胞受損，間隙增大，大分子物質透過血管進入肺間質及肺泡內，從而引起肺部一系列的病理生理改變。LPS引起急性肺損傷動物肺泡腔和間質中性粒細胞募集、肺泡壁變薄和蛋白水腫液聚集在肺泡腔;而LPS引起的細胞損傷主要與凋亡相關，上皮細胞在動物注入LPS后迅速凋亡并先于其他組織損傷發生［20］。

不同的動物對LPS的反應均不同。肺內有肺血管內皮巨噬細胞(pulmonary intravsascular macrophages，PIM)的動物如綿羊、牛、豬、貓、馬等動物注入少量的LPS就會引起顯著的膿毒癥和肺損傷癥狀，肺內沒有PIM的動物如狗、小鼠、大鼠和兔需要高劑量的LPS才會引起肺損傷。上世紀90年代，研究LPS致小動物急性肺損傷難以獲得滿意的治療效果，當時Deitch［21］認為很多的動物實驗并沒有復制出人類肺損傷接受治療的條件，Benjamin等［3］認為很多小動物肺損傷治療干預實驗中沒有對小動物進行機械通氣，因為人類ALI/ARDS進行的支持療法就包含了機械通氣，對鼠科類動物實行機械通氣會比較困難。但是隨著科技的進步，目前人類使用的呼吸機可應用于小動物并且小動物呼吸機也廣泛運用，這為今后開展更進一步的小動物急性肺損傷實驗研究提供了幫助。體型較大的動物耐受力強，并方便實施人類所使用呼吸機通氣，所以筆者認為，資金寬裕的條件下，采用體型較大的動物進行更接近復制人類ALI/ARDS生理變化。

2．2 機械通氣致肺損傷模型(ventilator-induced lung injury，VILI) 上世紀80年代和90年期間，一些實驗動物研究表明機械通氣會造成肺部炎癥反應和損傷，這些研究改變了重癥監護室護理病人的方式。機械所致肺損傷動物模型主要出現的病理損傷是肺間質變薄和肺泡中性粒細胞浸潤。其中體型較大的動物易現透明膜現象，而鼠科類動物則較少出現。

實驗動物VILI與臨床上所致VILI有幾點不同。最明顯的不同是損傷時間和肺的大小，大多動物機械肺損傷實驗研究在1～8h內完成，而臨床上采集的機械通氣肺損傷數據需24h或更長時間;另外，人和動物的肺部結構差異會影響到傷后病理組織表現。

固有免疫系統在VILI中發揮了重要作用，這已成為共識。許多生物學因子在VILI發生時自身會有明顯變化，問題也隨之而來，眾多改變的生物學因子與VILI有多少關聯?事實上，即使“專家”也難以給出確切答案。Wilson和Takata［22］根據研究成果提出3點篩選與VILI相關的炎癥遞質:(1)選擇上游因子作為研究指標;(2)應認識到VILI的病理進程中生物學因子起關鍵調節作用，而不僅是起一般的細胞炎癥功能;(3)目標因子/通路的調節功能應該有說服力、客觀和生理相關性。

2．3 “二次打擊”急性肺損傷模型 上世紀90年代提出了“二次打擊”概念，ALI/ARDS病人發生的機制非常復雜，很少因為一種“打擊”因素發生。“二次打擊”模式源于臨床觀察提出，現已得到臨床和研究人員的普遍認可。“二次打擊”所致肺損傷原理大致是由一個不太嚴重的創傷或其他某種方式(第一次打擊)預激機體，而隨后的感染或非感染因素造成的第二次損害引發炎癥反應失控造成肺損傷［23－24］。常見的“二次打擊”"急性肺損傷模型有失血-內毒素、缺血再灌注-盲腸穿刺結扎、休克-內毒素、肺挫傷－內毒素等模型。臨床ALI/ARDS病人發生是一個復雜和多因素參與的疾病過程，應用“二次打擊”急性肺損傷模型能更好解釋ALI的發生，也更符合臨床ALI/ARDS病人的病理生理過程。

3 ARDS“柏林定義”

2011年歐洲危重病協會重新修訂了ARDS的定義，即“柏林定義”［25］，這一標準據經驗性評估來自于4個多中心臨床的4 188名ARDS病人數據和3個單中心生理學試驗的269名ARDS病人數據，并采用 meta分析所起草(表2)。1994年歐美聯合會議所提出的ARDS診斷標準已被許多實驗機構作為衡量急性肺損傷實驗動物建模是否成功的一個重要指標。新的ARDS診斷標準主要的變化是剔除了“ALI”這一定義和肺動脈楔壓(pulmonary artery wedge pressure，PAWP)≤18mmHg這一ARDS診斷標準。未來進行急性肺損傷實驗動物建模是否可以參考ARDS“柏林定義”這一診斷標準，需要進一步的實驗驗證。

表2 ARDS“柏林定義”

急性肺損傷動物模型是了解ARDS發病機制和探索其治療方法的重要手段。沒有任何一個動物模型能復制人類急性肺損傷的所有特征，無論哪種類型的急性肺損傷實驗動物模型都有其局限性。但是肺損傷實驗動物模型的研究對診療人類急性肺損傷還是發揮了很多很大作用，如動物模型實驗中意外發現了間充質干細胞旁分泌作用可減輕急性肺損傷程度。通過急性肺損傷實驗動物模型研究，目前臨床上針對急性肺損傷治療已經有了一定進展，但仍需要不斷改進肺損傷實驗動物建模，盡可能復制不同類型的急性肺損傷患者病理生理學特點，這樣才能更好將實驗室的成果應用到臨床上，由此減輕急性肺損傷患者病情并改善急性肺損傷患者預后。

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