金黃色葡萄球菌腸毒素C2對兔骨髓間充質干細胞增殖和成骨分化的實驗研究

董晨輝，王子明，杜全印，王 雨，黃 愷，王愛民

金黃色葡萄球菌腸毒素(staphylococcal enterotoxins，SEs)，屬于金黃色葡萄球菌和鏈球菌產生的家族龐大的致熱腸毒素，具有相似的結構、功能和序列的一致性。SEs由金黃色葡萄球菌編碼的蛋白質分子，不需要抗原提呈細胞(antigen-presenting cells，APC)處理而直接與主要組織相容性復合體(major histocompatibility complexⅡ，MHCⅡ)類分子結合，導致帶有特異性V節段CD34細胞大量增殖。其對T淋巴細胞的刺激能力是普通抗原的10萬倍以上，在極低濃度時即可產生很強的免疫反應［1－2］。金葡素注射液(商品名:恩格菲)在以往的臨床應用中，常作為抗腫瘤藥物應用于各種癌腫，在抗癌方面的研究中已經得到了深入研究［3－4］，但是金黃色葡萄球菌腸毒素 C2(Staphylococcal Enterotoxins C2，SEC2)同時作為一種加快骨折愈合的藥物研究，在其作用機制上沒有得到廣泛重視。

因此，本文就SEC2誘導兔骨髓間充質干細胞(rabbit bone marrowmesenchymal stem cells，rBMSCs)分化的劑量和時間進行系統分析研究，從而為臨床的推廣打下理論基礎。

材料與方法

1 實驗材料

新西蘭純種大耳白兔(4周齡)，雌性，體質量400～600g，由第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心提供并飼養;自由飲水攝食。實驗過程中對動物處置符合2006年科技部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。SEC2(由遼寧大學生命科學院生化教研室惠贈)，紫外分光光度計(BiO－RAD公司)，倒置顯微鏡、激光共聚顯微鏡(OLYMPUS公司)，優質胎牛血清(Gibco)，DMEM/F12(1:1)培養基(Hy-Clone)，CD44及CD45(Abcom公司)，堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)檢測試劑盒(碧云天公司)等。

2 實驗方法

2.1 rBMSCs的培養 實驗兔在3%戊巴比妥鈉(40mg/kg)耳緣靜脈麻醉后，側臥手術臺上，于髂后上嵴處剪毛備皮后消毒皮膚，鋪無菌洞巾，穿刺取骨髓，實驗步驟參考文獻［5－6］。倒置顯微鏡每日觀察細胞的生長狀態，第3天后半量換液，第10天當觀察到少量細胞變為梭形、貼壁，即全量換液，改為條件培養基，此后隔日換1次條件培養基。倒置顯微鏡隔日觀察，貼壁細胞達到80%以上可行傳代;直至細胞不能傳代、衰老死亡為止。

2.2 rBMSCs CD44以及CD45鑒定結果 取培養第3代細胞，細胞爬片生長48h后采用異硫氰酸熒光素標記的 CD44、CD45抗體(CD44-FITC、CD45-FITC)對培養細胞進行標記，避光抗體孵育12h后，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)復染細胞核，于37℃下避光孵育30min，90%丙三醇封片，應用激光共聚焦顯微鏡檢測標記情況。

2.3 在不同SEC2濃度梯度作用下細胞增殖檢測 根據文獻報道，設定區間為1～500μM，其中設立4個實驗組、1個對照組以及1個陽性對照組，陽性對照組選擇5mM維生素C;選擇處于第3代對數生長期的rBMSCs用不同濃度的腸毒素SEC2溶液(1、10、100、500ng/ml)共培養 24h，應用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法選擇吸光值(OD)490nm波長檢測誘導細胞增殖的情況。

2.4 成骨誘導作用檢測和鑒定 將第3代細胞輕微吹打后，以5×103/cm2接種至六孔板中，隨機分為2組。采用碧云天公司ALP測定試劑盒定量測定ALP。各組rBMSCs誘導28d后，消化、離心收集各組細胞，分別用250μl細胞培養上清液懸浮細胞，用細胞超聲破碎儀破碎細胞，離心后取上清定量測定ALP，分光光度計檢測，波長520nm。茜素紅染色進一步鑒定。

2.5 逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)半定量檢測成骨細胞目標標記物的表達情況 根據Genbank檢索兔相關的GAPDH、骨橋蛋白、膠原-1的基因序列，根據同源性，利用Primer Premier5．0軟件設計合成的特異性引物，引物序列如下:GAPDH:(sense)5V-GGG GAG CCA AAA GGG TCA TCA TC-3V，(antisense)5V-GCA GGT TTT TCT AGA CGG CAG GT-3V;骨橋蛋白(osteopontin):(sense)5V-CAC CAT GAG AAT CGC CGT-3V，(antisense)5V-CGT GAC TTT GGG TTT CTA CGC-3V;膠原-1(collagen I):(sense)5V-GCA CTG GAG AGG TGC ACT G-3V，(antisense)5V-GCT GAG TCT CAG GTC GCG-3V;由上海生工生物公司合成。按Trizol法提取細胞總RNA。按照兩步法RT-PCR試劑盒操作說明反轉錄cDNA，并通過PCR擴增，反應時序為:94℃預變性3min，94℃ 變性 30s，54℃ 退火 30s，72℃ 延伸 1min，共30個循環;72℃延伸10min，共5個循環。取擴增產物進行20g/L瓊膠糖凝膠電泳;35min后置于紫外凝膠成像儀中進行觀察，照相記錄。圖像用Adobe Photoshop軟件去色，轉換為TIF格式后用Tatal lab v1．10軟件分析目的條帶的光密度積分值V值(V值=平均吸光度值×條帶面積)，目的基因的表達相對光密度值(Rv):(骨橋蛋白:Rv=Vosteopontin/VGAPDH;膠原-1:RV=VcollagenI/VGAPDH)。

3 統計學分析

采用SPSS16.0統計學軟件對實驗組和對照組數據進行分析，結果以(±s)表示，各組總體上有無差別采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法，P＜0.05具有統計學意義。

結 果

1 rBMSCs形態學觀察

原代細胞培養中，在接種4～5h后，細胞開始貼壁，在24h左右可見少量細胞貼壁細胞形態大致呈梭型或者紡錘形生長，細胞核圓形或橢圓形，位置基本居中;而未貼壁的細胞則呈圓形，細胞核不清晰(如圖1a)。在細胞培養3～5d，對細胞進行換液;可見細胞團簇樣生長，細胞形態均一，胞核大小基本一致(如圖1b)。待細胞貼壁率達到80%左右，進行傳代培養，傳代后第2代(如圖1c)至第6代細胞增殖較快，且形態規則(如圖1d)。

圖1 兔rBMSCs培養倒置顯微鏡下圖片( ×100)

2 rBMSCSs CD44以及 CD45鑒定

實驗中rBMSCSs免疫熒光染色鑒定rBMSCSs標志抗原CD44的表達情況，共聚焦顯微鏡觀察可見95%以上rBMSCSs表達CD44(綠色，FITC標記)(圖2a～c)，而未檢測到CD45的表達(圖2d～f);如圖2a～f見藍色標記為rBMSCSs細胞核。

圖2 激光共聚焦鑒定rBMSCs表面標記物檢測

3 SEC2對rBMSCs細胞增殖的影響

MTT法顯示，倒置顯微鏡下觀察細胞的增殖情況，結果顯示，不同細胞濃度對細胞的增殖起著不同的作用，1μM至100μM時，對細胞的增殖有漸強的促進作用，而在250μM、500μM組，細胞增殖明顯受到抑制(圖3)。

圖3 不同濃度SEC2對RBMSCS增殖的影響

進一步，根據MTT增殖情況，選擇100μMSEC2對RBMSCSs進行誘導，在實驗第2、7、14天對細胞鏡下觀測結果如圖4所示，細胞增殖情況明顯，且在第16天進行茜素紅染色可見明顯礦化和鈣沉積。

圖4 SEC2誘導RBMSCSs成骨分化情況

4 ALP活性檢測

結果如表1所示，不同濃度的SEC2誘導RBMSCS后6d、10d及16d ALP活性由強到弱依次是:濃度為100μMSEC2組的細胞ALP活性最強，其余組的ALP活性均較對照組增強(P＜0.05)，但是要弱于10μMSEC2組。

表1 ALP活性檢測結果(金氏單位*/100ml)(n=8，±s)

表1 ALP活性檢測結果(金氏單位*/100ml)(n=8，±s)

與對照組相比:*P＜0.05，#P＜0.01;*1金氏單位=0.714 U/l

對照組SEC2誘導組1μM 10μM 100μM 500μM6d 9.87±1.18 8.41±2.10 12.24±2.15 18.87±1.18*6.87±2.08 10d 11.95±1.24 12.24±2.12 19.24±1.18* 22.65±2.18# 7.73±1.94 16d 12.87±1.98 17.15±1.84 21.54±1.18* 27.24±2.45#8.15±1.97

5 應用100μMSEC2與rBMSCSs共培養檢測骨橋蛋白mRNA以及膠原-1-mRNA的變化情況

根據 MTT檢測結果，選擇 100μMSEC2與RBMSCSs共培養 0、2、7、16d 后，RT-PCR 半定量方法檢測骨橋蛋白和膠原-1 mRNA的相對表達量;結果顯示:隨著共培養時間的延長，骨橋蛋白和膠原-1的表達量有著明顯的增加趨勢，P＜0.03，具有統計學意義(圖5)。

圖5 骨橋蛋白以及膠原-1 mRNA的相對表達量

討 論

金葡素注射液又名骨折愈合刺激素(商品名:恩格菲)，是利用現代生物技術從金黃色葡萄球菌的代謝產物中提取的含 有多種生物活性成分的新型生物制劑。其中富含各種生長調控因子、鳥氨酸及內、外源性酶。它能通過多種生物活性分子的相互作用，促進骨折區微血管形成，同時增加骨細胞及周圍組織微循環，起到加速骨折愈合的作用［7－8］。目前，對于金葡素注射液的成分檢測已經確認，其中主要的有效成分是SEC2［9］，其分子機制不詳。耿佳等［10］研究表明，金葡素注射液可治療早期股骨頭壞死的研究表明:金葡素注射液具有促進血管再生和骨組織形成的作用，能夠有效促進早期股骨頭缺血性壞死的修復，而用明膠海綿作為載體吸附金葡素注射液后植入減壓孔道后，能加速股骨頭壞死的修復。

研究表明，人骨髓間充質干細胞(human bone marrowmesenchymal stem Cells，hBMSCs)具有則增殖活躍及多向分化潛能，它在不同的誘導條件下，能向成骨細胞、成軟骨細胞等中胚層及神經外胚層組織細胞分化［11］。因此，hBMSCSs可以作為良好的組織工程種子細胞向骨細胞、成骨細胞以及軟骨細胞分化［12－13］;己有報道把hBMSCSs復合于生物支架材料治療骨缺損。

國內的研究中，對于SEC2研究多集中于金葡素注射液為主要方向，金葡素注射液主要通過兩種途徑加快骨代謝，促進骨的愈合，主要表現為:促進毛細血管增生，改善局部血供;促進成骨細胞分化成熟。然而，金葡素注射液中的主要成分SEC2作用于體外培養的成骨細胞，可顯著促進成骨細胞的礦化功能;而主要存在的問題:聯合應用抗壞血酸則會有更好的成骨作用，具體的機制仍不詳;并且在rBMSCs培養發現，SEC2能促進rBMSCs向成骨細胞分化和成熟，從而達到促進成骨細胞生成，加速骨折的愈合;同時觀察到rBMSCs在高濃度SEC2的誘導下增殖減慢，這可能與高濃度的SEC2細胞毒性增強，對細胞的增殖抑制有關。

ALP是成骨細胞分化早期重要指標之一［14］，它標志著成骨分化的程度。ALP活性越強，表明成骨分化程度越高。實驗中發現RBMSCs在誘導后第7天時就可以呈現陽性表達，而對照組則為陰性，這說明SEC2誘導后的rBMSCs具有成骨特性。成骨誘導培養顯示在第7天時誘導組明顯可以看出細胞形態的改變，有類似鈣結節樣改變，在第16天茜素紅染色可見明顯礦化和鈣沉積;進一步RT-PCR檢測成骨分化相關因子mRNA變化中發現，rBMSCSs經成SEC2誘導分化后，膠原-1有明顯的增加趨勢;根據已有文獻［12］，膠原-1由成骨細胞以原膠原的形式分泌，在基質中被迅速裂解，是骨有機質的主要成分，約占骨基質蛋白的80% ～90%。本實驗通過膠原-1 mRNA相對表達量明顯增加，表明誘導后的細胞合成能力增強。骨橋蛋白同樣是人體主要的非膠原蛋白，能調節羥基磷灰石晶體生長;因此，骨橋蛋白被認為是成骨細胞成熟分化的標志，實驗表明:實驗組的骨橋蛋白含量明顯高于對照組，差異有統計學意義，充分說明SEC2具有促進rBMSCs向成骨細胞分化作用。

總之，本實驗證實了應用SEC2與rBMSCSs共培養后，在極低濃度可促進細胞增殖，同時誘導細胞向成骨細胞分化發現，增加細胞胞漿中骨橋蛋白和膠原-1的表達，從而證實SEC2具有成骨細胞分化作用，為下一步行研究SEC2的分子機制打下理論基礎。

［1］ Wood AC，Todd I，Cockayne A，et al．Staphylococcal enterotpxins and the immune system［J］．FEMS Microbiol Lett，1991，3(3):121 －133．

［2］ Gillaspy AF，Iandolo JJ，Moselio S．Encyclopedia of microbiology［J］．Oxford:Academic Press，2009，36(9)293 －303．

［3］ Landman GW，Groeneveld PH．Staphylococcal toxic shock syndrome，superantigenicity and hypersensitivity［J］．Clin Infect Dis，2010，50(9):1326 －1340．

［4］ Cheng X，Cao P，Ji X，et al．Antitumour response of a double mutant of staphylococcal enterotoxin C2 with the decreased affinity for MHC class II molecule［J］．Scand J Immunol，2010，71(3):169 － 175．

［5］ Chen ZZ，Jiang XD，Zhang LL，et al．Beneficial effect of autologous transplantation of bone marrowstromal cells and endothelial progenitor cells on cerebral ischemia in rabbits［J］．Neurosci Lett，2008，445(1):36 －41．

［6］ Roostaeian J，Carlsen B，Simhaee D，et al．Characterization of growth and osteogenic differentiation of rabbit bone marrowstromal cells［J］．J Surg Res，2006，133(2):76 －83．

［7］余建平，蘇云星，劉芳．膠原－明膠海綿作為金葡素注射液載體修復骨缺損的實驗研究［J］．山西醫藥雜志，2008，37(1):26 －28．

［8］馮文嶺，鄭旺．膠原蛋白膜作為金葡素注射液載體修復骨缺損的實驗研究［J］．中國修復重建外科雜志，2005，19(5):350－353．

［9］ Ding D，Huang P，Sun HY，et al．Identification of protein components and quantitative immunoassay for SEC2 in staphylococcin injection［J］．J Pharm Biomed Anal，2009，50(1):79－85.

［10］耿佳，張元和，唐磊．金葡素注射液治療兔早期股骨頭缺血性壞死的研究［J］．中國醫學工程，2011，19(7):54－55．

［11］ Jorgensen C，Gordeladze J，Noel D．Tissue engineering through autologous mesenchymal stem cells［J］．Curr Opin Biotechnol，2004，15(5):406 －410．

［12］ Fisher M，Hyzy S，Guldberg RE，et al．Regeneration of bone marrowafter tibial ablation in immunocompromised rats is age dependent［J］．Bone，2009，46(2):396 －401．

［13］ Quintavalla J，Uzielfusi S，Yin J，et al．Fluorescently labeled mesenchymal stem cells(MSCs)maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects［J］．Biomaterials，2002，23(1):109－119．

［14］ Lock J，Nguyen TY，Liu H．Nanophase hydroxyapatite and poly(lactide－co－glycolide)composites promote human mesenchymal stem cell adhesion and osteogenic differentiation in vitro［J］．J Mater Sci Material Med，2012，23(10):1007－1012.