腫瘤壞死因子-α與聲門不同狀態下肺撞擊傷關系的研究

吳秋平，閆 進，蔣 力，張在永，閔家新

肺是胸部撞擊傷最常累及的人體重要器官，胸部撞擊傷后的肺挫傷、急性肺損傷(ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)都是常見的致死性器官繼發性損傷［1］。ALI的實質是各種原因引起的全身炎癥反應綜合征在肺部的表現，ARDS只是ALI嚴重階段。目前認為創傷導致全身性炎癥反應和器官功能損害時，腫瘤壞死因子(TNF-α)在機體炎癥反應與抗炎反應中起關鍵作用［2］。TNF-α具有廣泛的生物活性，是引起組織細胞損傷的重要遞質。胸部撞擊致肺損傷的過程中，炎癥細胞產生TNF-α的作用尚鮮見報道。為此，本研究采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測傷側肺組織TNF-αmRNA的表達，為胸部撞擊傷后繼發性肺損傷提供依據。

材料與方法

1 實驗動物及分組

新西蘭實驗兔54 只，體質量(2．28 ±0．35)kg，雌雄不限，第三軍醫大學第三附屬醫院野戰外科研究所實驗動物中心提供。隨機方法分為正常對照組6只，聲門開放和緊閉兩組各24只，兩種聲門狀態分別按2、4、8、12h 4個時相點又各分為4組，每組6只。

2 致傷方法

1．5%戊巴比妥鈉1ml/kg兔耳緣靜脈注射麻醉后，頸部切口，行氣管插管術，通過使氣管導管開放和夾閉來模擬聲門開放和緊閉生理狀態。致傷動物采用BIM-Ⅱ型生物撞擊機，對兔右側胸部準靜態正面撞擊，撞擊部位為右鎖骨中線第4肋間。致傷參數設置為［3］:驅動壓力800kPa，壓縮量30%，撞擊面積 1．77cm2。

3 RT-PCR反應

3.1 肺組織總RNA提取 取1mg肺組織放入加有0．8ml試劑盒的勻漿器中，冰上勻漿。并按操作說明書提取組織中的總RNA，-70°C保存備用。

3.2 基因片段擴增 TNF-α上游引物5’-GTA GCA AAC CCG CAA GTG GA-3’，下游引物 5’-GGC AAT GAT CCC AAA GTA C-3’，長度370bp。以肌動蛋白(β-Actin)為參照，上游引物5’-AGC CAT GTA CGT AGC CAT CC-3，下游引物 5’-CTC TCA GCT GTG GTG GTG GTG AA-3’。引物由北京中山生物技術有限公司合成。試劑盒購自TAKARA公司，逆轉錄反應體系:MgCl24μl、10 × RNA 緩沖劑 2μl、dNTP 混合物 2μl、RNase 抑制劑0．5μl、AMV 反轉錄酶 1μl、Oligo dT-接頭引物 1μl、樣品(≤1ug total RNA)、RNase Free dH2O，反應總體積 20μl。反應條件為42°C 逆轉錄 30min，99°C 預處理 5min。PCR反應體系如下:dd H2O 14．25μl、10 ×EX Taq buffer(Mg2+free)2．50μl、Mg2+CL 2．00μl、dNTP 2．00μl、EX Taq 0．25μl、Up-primer1．00μl、Dn-primer1．00μl cDNA 2．00μ，體積 25．00μl。擴增條件:94℃ 變性50sec;60℃退火58sec;72℃延伸1min，進行30個循環，72℃再延伸8min，產物-20℃保存備用。

3.3 PCR產物定量分析 樣品及內參PCR產物各8μl充分混勻后于1．2%瓊脂糖凝膠電泳1h;凝膠成像系統中分析各條帶的灰度值，TNF-α與β-Actin比值，應用統計學檢驗方法對各組數據進行分析。

4 病理學觀察

動物活殺后，取傷側肺組織做光、電鏡檢查。

5 統計分析

采用SAS6．12軟件包對數據作一般描述，對比分析，包括t檢驗、方差分析，q檢驗等。

結 果

1 病理改變

大體標本可見胸壁瘀血、肋骨骨折;雙肺有散在或點片狀或片狀出血，以肺上葉和肺門處明顯，肺葉可見與肋骨平行的出血性壓痕;部分兔可見肺臟撕裂、支氣管斷裂。光鏡可見肺組織呈多灶性、不規則片狀出血、支氣管內有紅細胞、局部性肺水腫或肺不張。電鏡下肺泡Ⅱ型細胞退變壞死、微絨毛脫落、板層體空化、線粒體腫大、肺間質粒細胞浸潤、毛細血管粒細胞阻塞(圖1、2)。

圖1 板層體空化，內皮細胞腫脹明顯(透射電鏡 ×10000)

圖2 肺組織大量炎性細胞浸潤，血管腔內紅細胞和炎性細胞滯留并黏附于血管內皮(HE染色 ×400)

2 肺組織TNF-αmRNA的表達

聲門不同狀態下撞擊側肺組織中TNF-αmRNA傷后不同時相點有不同的表達，在傷后2h時，聲門緊閉與開放兩組該指標差別無統計學意義(P＞0．05);至傷后4h時，聲門緊閉與開放兩組肺組織中TNF-αmRNA達到峰值(聲門緊閉組 2．278±0．197，聲門開放組 1．686 ± 0．101)，之后該值逐漸下降，傷后 4、8、12h聲門緊閉組 TNF-αmRNA 的表達顯著高于聲門開放組(P＜0．05)(表1)。撞擊側肺組織中TNF-αmRNA各時相點顯著高于與對照組(P ＜0．05)。

表1 右肺組織TNF-α mRNA的表達(n=6)

討 論

肺撞擊傷后早期主要表現為因機械性損傷因素導致的肺泡內出血，隨著時間的推移逐漸發展為肺間質水腫、炎癥細胞浸潤等改變。肺組織病理改變也表現為挫傷區域中心的肺泡內出血，大量紅細胞浸潤，肺泡結構破壞，而其周圍可見肺間質腫脹、增寬，間質毛細血管內血流瘀滯，白細胞附壁，間質及肺泡內大量炎癥細胞(主要為中性粒細胞)浸潤［4］。單純的機械性損傷因素不能解釋上述繼發性改變。嚴重創傷引起機體神經、內分泌和免疫系統的反應，在炎性細胞因子作用下，表現為全身性瀑布式炎癥反應，發展到一定程度則演變為多器官功能障礙綜合征(MODS)［5］。肺臟首先遭到損害，表現為持續的頑固性低氧血癥及呼吸窘迫的臨床特點。

TNF-α主要是由單核一巨噬細胞應答各種刺激時所產生的一種細胞因子，其生物活性廣泛，與炎癥關系密切［6］。它可誘導動物出現急性肺損傷［7］，有研究表明［8-9］:TNF-α主要來源于脂多糖(LPS)刺激的單核、巨噬細胞等，在各種原因所致的ALI過程中，TNF-α主要通過下列途徑發揮作用:(1)誘導其它細胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-8等前炎細胞因子產生和釋放，造成機體損傷的同時，因可通過再激活炎癥效應細胞，釋放更多的炎性因子，使炎癥信號進一步放大和加強，產生“級聯放大”作用;(2)直接損傷肺血管內皮細胞和肺泡Ⅱ型上皮;(3)與其它細胞因子相互作用引起肺組織損傷;(4)激活補體和凝血系統，促進炎癥在肺組織中的擴散。

本實驗結果表明，聲門不同狀態下撞擊側肺組織中TNF-αmRNA傷后不同時相點有不同的表達，在傷后2h時，聲門緊閉與開放兩組該指標差別無統計學意義(P＞0．05)，至傷后4h時，聲門緊閉與開放兩組肺組織中TNF-αmRNA達到峰值(聲門緊閉組2．278 ±0．197，聲門開放組 1．686 ±0．101)，之后該值逐漸下降。說明炎癥早期，肺泡巨嗜細胞激活、TNF-α產生增加，并促使多性核中性白細胞(PMN)聚集、遷移至肺內，使PMN成為分布最廣數量最多的炎性細胞，同時又是 TNF-α更大的來源，提示TNF-α參與創傷性肺損傷的發生發展，撞擊傷后肺組織中TNF-αmRNA出現過度表達，促進了中性粒細胞的趨化、聚集，可能對肺血管通透性增加、間質水腫、出血壞死及最終導致創傷性ALI的發生起重要作用。

TNF-α參與肺損傷機制較為復雜，目前認為有以下幾種觀點:TNF-α被視為機體炎癥反應的啟動物質［10］，它能迅速啟動單核-巨噬細胞和內皮細胞，促進趨化因子和黏附因子的合成，促成中性粒細胞在肺內聚集與激活的級聯反應［11］。肺血管內皮細胞在炎癥因子的作用下受到損傷，血管通透性增加，血管內容物外滲，造成肺水腫［12-13］。TNF-α 不僅發揮直接的內皮細胞損傷作用，還可通過與其受體結合誘導其他細胞因子合成與釋放，致使組織發生炎癥損傷［14］。本實驗直接檢測肺組織中 TNF-αmRNA含量，發現肺損傷程度與肺組織中TNF-αmRNA含量成正相關，即肺組織中TNF-αmRNA含量越高，肺損傷程度就越重。本實驗傷后4、8、12h聲門緊閉組TNF-αmRNA的表達顯著高于聲門開放組(P＜0．05))，說明聲門緊閉狀態下肺撞擊傷的程度重于聲門開放狀態。

撞擊直接損傷可導致肺臟出血和水腫，是物理因素所造成的原發傷，而內皮細胞和上皮細胞變性、細胞間隙增寬、通透性增強等應視為急性繼發性肺損傷。盡管繼發性損傷中有撞擊參數如驅動壓和壓縮量等物理因素所致，但從本實驗結果來看，細胞因子TNF-α在其中扮演了重要的角色［15］。由于與創傷有關的細胞因子很多，各細胞因子之間相互影響、相互作用，呈網絡樣。因此，要全面闡述細胞因子在加重肺撞擊傷中的作用和地位，需要進一步深入研究。

［1］石應康．急性肺損傷的研究進展［J］．中華創傷雜志，2000，16(11):645-647．

［2］陳德昌．全身性感染與機體免疫反應［J］．基礎醫學與臨床，1998，18(1):1-4．

［3］吳秋平，蔣耀光，何家慶，等．聲門緊閉狀態下肺撞擊傷模型的建立［J］．創傷外科雜志，2004，6(4):269-272．

［4］周建華，徐志飛，孫耀昌．兔肺挫傷后血清白細胞介素-6水平變化與肺水腫的關系［J］．中華創傷雜志，2000，16(11):651-653．

［5］ Seeley EJ．Updates in the management of acute lung injury:a focus on the overlap between AKI and ARDS［J］．Adv Chronic Kidney Dis，2013，20(1):14-20．

［6］孫耕耘，毛寶齡，呂寶璋．白細胞介素-1、腫瘤壞死因子與炎癥［J］．生理科學進展，1993，24(1):23-28．

［7］ Stephens KE，Ishizaka A，Larrick JW，et al．Tumor necrosis factor causes increased pulmonary permeability and edema．Comparison to septic acute lung injury［J］．Am Rev Respir Dis，1988，137(6):1364-1370．

［8］ Fr?hlich S，Boylan J，McLoughlin P．Hypoxia-induced inflammation in the lung:a potential therapeutic target in acute lung injury［J］．Am J Respir Cell Mol Biol，2013，48(3):271-279．

［9］ Allen JN，Herzyk DJ，Allen ED，et al．Human whole blood interleukin-1-beta production:kinetics，cell source，and comparison with TNF-alpha［J］．J Lab Clin Med，1992，119(5):538-546．

［10］ Tracey KJ，Beutler B，Lowry SF，et al．Shock and tissue injury induced by recombinant human cachectin［J］．Science，1986，234(4775):470-474．

［11］ Martin TR．Lung cytokines and ARDS:Roger S．Mitchell Lecture［J］．Chest，1999，116(1S):2-8．

［12］ Kabir K，Gelinas JP，Chen M，et al．Characterization of a murine model of endotoxin-induced acute lung injury［J］．Shock，2002．17(4):300-303．

［13］ Wu Y，Singer M，Thouron F，et al．Effect of surfactant on pulmonary expression of type IIA PLA(2)in an animal model of acute lung injury［J］．Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2002，282(4):L743-750．

［14］ Calkins CM，Heimbach JK，Bensard DD，et al．TNF receptor I mediates chemokine production and neutrophil accumulation in the lung following systemic lipopolysaccharide［J］．J Surg Res，2001，101(2):232-237．

［15］ Li T，Luo N，Du L，et al．Tumor necrosis factor- α plays an initiating role in extracorporeal circulation-induced acute lung injury［J］．Lung，2013，191(2):207-214．