MK-801對改善實驗性創傷性腦損傷后腦細胞線粒體呼吸作用的研究

代文光，秦曉勇，李良慧，宋學良，馮 玥，李 臻

目前，許多實驗研究證實創傷性腦損傷后，腦組織缺血、缺氧，神經細胞水腫，同時神經細胞膜離子通透性，中樞神經遞質等化學物質及能量代謝、腦血管調節功能均出現障礙。有學者研究發現創傷性腦損傷后腦缺血、神經細胞膜離子通透性、血管調節功能障礙是造成腦水腫的重要原因之一。已用于抗腦水腫的治療藥物及措施很多，研究發現腦缺血期及缺血后再灌流腦線粒體的呼吸功能相繼惡化。可能的機制包括腦內自由基的含量變化，腦細胞內的pH值，Ca2+、Mg2+穩態和自由脂肪酸的變化等［1］。Steven等［2］于1986年提出腦缺血時興奮性氨基酸過度釋放，通過作用于突觸后受體產生神經毒性作用，參與缺血腦損傷的過程。MK-801系N-甲基-D-天門冬氨酸(N-mechyl-D-aspartate，NMDA)受體拮抗劑，能有效阻滯興奮性氨基酸與突觸后受體結合，從而保護神經元免受損傷，但MK-801能否改善創傷性腦損傷后腦線粒體呼吸功能，目前國內外文獻尚未見報道。本實驗通過觀察大鼠創傷后MK-801治療前后腦線粒體呼吸控制率(RCR)的變化，為創傷性腦損傷的治療提供實驗依據。

材料與方法

1 動物分組

雄性Wistar大鼠(中國人民解放軍野戰外科研究所動物實驗中心提供)共80只，11～13周齡，體重160～280g。隨機分為4組:對照組20只，創傷未治組(非治療組)20只，治療24h組(治療Ⅰ組)20只，治療72h組(治療Ⅱ組)20只。

2 動物致傷

氣體沖擊致傷動物模型制備參考劉海鵬等［3］報道的方法。造成大鼠左大腦半球中等度局部腦挫裂傷，對照組只做動物麻醉及顱骨鉆孔，不做沖擊致傷。

3 動物處理

(1)對照組:麻醉后左頂顱骨鉆孔后縫合頭皮，傷后72h斷頭處死;(2)非治療組:氣體沖擊致傷后72h處死;(3)治療Ⅰ組:氣體沖擊致傷后，腹腔內立即注射MK-801液1mg/kg(MK-801原粉+0．9%氯化鈉注射液配成0．2mg/ml)傷后72h斷頭處死;(4)治療Ⅱ組:氣體沖擊致傷后腹腔內立即注射MK-801液1mg/kg(MK-801原粉+0．9%氯化鈉注射液配成 0．2mg/ml)，傷后 24、48h分別重復注射MK-801液1mg/kg(MK-801原粉+0．9%氯化鈉注射液配成0．2mg/ml)，傷后72h斷頭處死。

全部動物均喂以標準顆粒飼料(中國人民解放軍野戰外科研究所動物實驗中心提供)，自由飲水。

所有動物斷頭處死后，迅速分離腦組織，取大腦半球，去除腦干和小腦，置于0～2°C生理鹽水中洗滌數次，立即埋入帶有冰渣的預先稱取重量的分離遞質中，稱重后用以分離線粒體。以上操作在30s內完成。

4 線粒體分離與呼吸功能測定

參照Clark等［4］方法進行線粒體分離。線粒體蛋白含量測定按Lowry法［5］，以牛血清蛋白為標準。線粒體呼吸功能測定:參見Chance和Williams［6］的方法，反應池體積為 1．6ml，溫度恒定在 30°C，用Clark氧電極測定線粒體氧耗。反應遞質(225mmol/L甘露醇;75mmol/L蔗糖;5mmol/L磷酸 鹽-Tris，pH7．4;10mmol/LTris-HCl，pH7．4;0．05mmol/L K+-EDTA;5mmol/L KCl)以空氣飽和，加入0．1ml線粒體懸液，預溫1min后加入1．25mmol/L谷氨酸和蘋果酸鈉各 10μl。間隔 1min后加入0．2mmol/L ADP 4μl。分別于ADP存在時(Ⅲ態呼吸，ST3)和ADP耗盡后(Ⅳ態呼吸，ST4)測定線粒體氧耗速度，計算呼吸控制率(RCR=ST3/ST4)。

5 電鏡觀察

將提純的腦線粒體沉淀1mm3置入3%戊二醛固定液中固定。沖洗后，1%俄酸固定，逐步丙酮脫水，環氧樹脂618包埋，制超薄切片H-300型電鏡掃描觀察，記錄并照像。

6 統計學處理

結 果

1 MK-801對創傷性腦損傷大鼠線粒體呼吸功能的影響

實驗結果表明:傷后未治組24、72h腦線粒體呼吸功能明顯下降，其特點為呼吸Ⅲ態和呼吸控制率明顯下降;治療Ⅰ組盡管呼吸Ⅲ態、呼吸控制率有所恢復，但仍低于對照組(P＜0．01)，其呼吸Ⅲ態及呼吸控制率分別下降至對照組的74．44%和69．74%呼吸Ⅳ態稍有延長，但相差不顯著;治療Ⅱ組呼吸功能與對照組比仍有非常顯著差異，較治療Ⅰ組呼吸Ⅲ態，呼吸控制率有顯著升高(P＜0．05)，呼吸Ⅳ態稍有延長，但相差不顯著(見表1)。

2 電鏡結果

對照組線粒體結構完整;未治組線粒體結構受損嚴重，嵴斷裂，核膜不完整，腫脹明顯，空泡變性;治療Ⅰ組線粒體嵴斷裂、腫脹，較未治組輕，部分空泡變性;治療Ⅱ組線粒體嵴斷裂、腫脹，與治療Ⅰ組無差別，仍有部分空泡變性(圖1～4)。

表1 MK-801對創傷性腦損傷大鼠腦線粒體呼吸功能影響(n=20，±s)

表1 MK-801對創傷性腦損傷大鼠腦線粒體呼吸功能影響(n=20，±s)

與對照組比較:*P ＜0．01;與非治組比較:▲P ＜0．01;與治療Ⅰ組比較:△P ＜0．05

組別 呼吸Ⅲ態 呼吸Ⅳ態 呼吸控制率對照組10．45 ±0．90 3．02 ±0．31 3．47 ±0．24非治療組 6．25 ±0．74* 3．34 ±0．45 1．87 ±0．34*治療Ⅰ組 7．79±0．81＊▲ 3．21±0．51 2．41±0．41＊▲治療Ⅱ組 8．45±0．43＊▲△ 3．18±0．45 2．67±0．31＊▲△

圖1 對照組大鼠腦線粒體超微結構，線粒體結構完整，無腫脹，嵴膜完整，無嵴斷裂及空泡變性(×12500)

圖2 創傷未治組大鼠腦線粒體超微結構，線粒體結構嚴重受損，嵴斷裂，嵴膜不完整，腫脹明顯，空泡變性(×12500)

圖3 治療Ⅰ組大鼠腦線粒體超微結構，線粒體嵴斷裂，腫脹較未治組輕，部分空泡變性(×12500)

圖4 治療Ⅱ組大鼠腦線粒體超微結構，線粒體嵴斷裂、腫脹，與治療Ⅰ組無差異，仍有部分空泡變性(×12500)

討 論

1 創傷性腦損傷對腦線粒體呼吸功能的影響

呼吸Ⅲ態(ST3)為在有底物和ADP刺激下線粒體氧化磷酸化能力，呼吸Ⅳ態(ST4)為只有底物刺激下線粒體呼吸鏈的功能。本實驗結果表明腦外傷后ST3均下降，而非治療組及治療組呼吸Ⅳ態卻較對照組輕度升高，但無統計學意義。呼吸控制率為線粒體呼吸功能的敏感指標，創傷組及治療組較對照組下降非常顯著，治療組較非治療組又明顯升高。ST3是代表ADP對線粒體氧化呼吸刺激效應的指標，ST3和RCR下降說明ADP對呼吸鏈電子傳遞的控制程度降低，反應氧化磷酸化過程在一定程度上脫偶聯。也有觀點認為，缺氧狀態下，線粒體內ATP含量下降，長鏈脂酰輔酶A和花生四烯酸堆積以及鈣超載均可抑制呼吸鏈上的電子傳遞［7］。ST4代表ADP耗盡后線粒體維持正常的形態，結構所必需的基礎氧耗。創傷性顱腦損傷ST4輕度升高，可能和傷后線粒體內外鈣循環加速、ATP/ADP轉運載體受抑制有關［8-9］。據此筆者推測，缺氧可能通過多種途徑影響線粒體呼吸功能，主要表現為電子傳遞受阻。目前已有研究表明，急性缺氧引起線粒體變性、壞死，而慢性缺氧則引起線粒體數目增多，mtDNA拷貝數增加，從而達到代償作用［10-12］。而創傷性顱腦損傷后腦線粒體缺氧在早期主要是由于創傷后腦水腫、腦腫脹、顱內壓升高、腦血管舒縮功能障礙以及傷后呼吸暫停窒息等原因造成的急性缺氧，此后由于細胞代謝產物積聚加重缺氧而出現慢性缺氧。

2 MK-801治療創傷性腦損傷后腦線粒體呼吸功能改善的機制

本實驗應用MK-801治療創傷后腦線粒體呼吸功能較未治組明顯改善，其機制目前尚未完全清楚，可能與下列因素有關。

2.1 對細胞鈣離子等通透性的影響 MK-801具有維持線粒體內外離子穩態作用。實驗表明，線粒體內鈣離子超載時引起顱腦損傷后線粒體功能障礙的重要因素，MK-801作為一種強有力的非競爭性的NMDA拮抗劑主要通過拮抗NMDA受體偶聯的Ca2+通道，抑制Ca2+內流。同時MK-801可以維持線粒體氧化磷酸化過程，保證較為充足的ATP合成，從而使線粒體膜上的鈣泵得以維持線粒體內外Ca2+平衡，從而減輕創傷性腦水腫形成［13-14］。

2.2 對中樞神經遞質等化學物質的影響、減輕自由基的損害 顱腦損傷后由于各種因素導致氧自由基產生過程呈“聯鎖”反應，在很短時間內產生大量的氧自由基，超過了線粒體的清除能力。氧自由基脂質氧化反應的最終代謝產物MDA的含量反應線粒體的氧自由基水平，線粒體SOD的活性反應可以反映線粒體清除自由基的能力，MK-801作為一種強有力的非競爭性的NMDA拮抗劑參與線粒體的氧化磷酸化功能從而保護線粒體的呼吸功能。

2.3 MK-801阻滯興奮性氨基酸與突觸后受體結合的同時也能阻滯正常氨基酸與突觸后受體結合，從而使MK-801目前尚難以用于臨床治療創傷性腦損傷。需進一步探索MK-801改善創傷性腦損傷后腦線粒體呼吸功能的機制，為其臨床應用提供確切的理論依據。

3 MK-801對創傷性顱腦損傷后腦線粒體超微結構的影響

資料表明，創傷性顱腦損傷后導致腦缺血、缺氧的損傷中，線粒體的改變發生最早，表現為線粒體內Ca2+聚集，造成線粒體腫脹，嵴斷裂等細胞器損害［15］。本實驗結果顯示，正常組視野內線粒體結構完整，無腫脹，峭膜完整，無嵴斷裂及空泡變性;未治組線粒體結構受損嚴重，嵴斷裂，核膜不完整，腫脹明顯明顯，空泡變性;治療Ⅰ組線粒體嵴斷裂，腫脹較未治組輕，部分空泡變性;治療Ⅱ組線粒體嵴斷裂、腫脹與治療Ⅰ組無差別，仍有部分空泡變性。說明MK-801不僅對創傷性腦損傷后腦線粒體的呼吸功能而且對其超微結構也有改善作用。總之，隨著對MK-801改善創傷性腦損傷后腦線粒體呼吸功能的深入研究，必將為臨床治療創傷性顱腦損傷開辟新的途徑。

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