探究負(fù)蝗腸道菌除草活性的實(shí)驗(yàn)活動(dòng)

摘要：昆蟲(chóng)腸道菌因其數(shù)量和種類(lèi)的多樣性而成為新穎天然產(chǎn)物的廣泛來(lái)源，本活動(dòng)通過(guò)分離與培養(yǎng)負(fù)蝗腸道菌，發(fā)現(xiàn)該腸道菌經(jīng)小量液體發(fā)酵后獲得的菌液對(duì)稗草種子生長(zhǎng)有97.3%的抑制率，在拓展學(xué)生微生物實(shí)驗(yàn)技能的同時(shí)，也幫助學(xué)生探究了昆蟲(chóng)和腸道菌二者的互利共生關(guān)系。

關(guān)鍵詞：負(fù)蝗 腸道菌 除草活性 種間關(guān)系

中圖分類(lèi)號(hào)：G633.91 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

1、引言

昆蟲(chóng)腸道內(nèi)棲息著的微生物不僅數(shù)量龐大，又因昆蟲(chóng)的類(lèi)別以及腸道結(jié)構(gòu)的多樣性，其種類(lèi)也特別豐富，昆蟲(chóng)和腸道菌二者之間存在著廣泛、非致病的共生關(guān)系。本研究主要內(nèi)容為分離負(fù)蝗腸道菌，并探究該菌株代謝產(chǎn)物的除草活性，是學(xué)生在學(xué)習(xí)人教版高中生物選修l“微生物的培養(yǎng)技術(shù)”后，對(duì)該技能的應(yīng)用與拓展。此外，學(xué)生通過(guò)必修3“生物的群落”一課的學(xué)習(xí)，知曉互利共生關(guān)系作是一種重要的種間關(guān)系，但中學(xué)階段尚缺少相關(guān)適宜的探究或驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，而中負(fù)蝗與其腸道菌之間作為共生關(guān)系的一個(gè)例證，能為高中生物教師開(kāi)展探究種間共生關(guān)系的實(shí)驗(yàn)活動(dòng)提供參考思路。

2、實(shí)驗(yàn)原理

負(fù)蝗是直翅目蝗科的一種較常見(jiàn)昆蟲(chóng)，為農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，可在草叢以及稻、麥、高粱、玉米等作物間發(fā)現(xiàn)。負(fù)蝗腸道內(nèi)棲息著一種叫做彎孢菌的微生物，它產(chǎn)生的根匍柄菌素和鄰苯二甲酸正丁異丁酯兩種化合物具有顯著的除草活性和抗真菌活性。本實(shí)驗(yàn)需解剖負(fù)蝗腸道，研磨并稀釋10倍，經(jīng)涂布平板法獲得腸道菌，再通過(guò)小量的液體發(fā)酵，因其發(fā)酵液中含有該腸道菌上述的兩種代謝產(chǎn)物，通過(guò)培養(yǎng)皿生物分析法便可測(cè)其除草活性。

3、實(shí)驗(yàn)材料和器具

實(shí)驗(yàn)材料：負(fù)蝗、稗草種子、生麥芽、葡萄糖、蛋白胨、瓊脂、無(wú)菌水。

實(shí)驗(yàn)器具：解剖刀、鑷子、研缽、試管、搪瓷杯、三角錐瓶、紗布、濾紙片、無(wú)菌操作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋。

4、實(shí)驗(yàn)方法

麥芽培養(yǎng)基的配置：稱(chēng)量20 g的生麥芽置于搪瓷杯內(nèi)，加入300 mL的水，沸煮15 min，再將汁液經(jīng)紗布過(guò)濾到大燒杯中，剩余的麥芽再重復(fù)沸煮l 5 min，將兩次汁液混合，再加入20 g葡萄糖、1 g蛋白胨、15～20 g瓊脂，加水至1 000 mL。培養(yǎng)基及相關(guān)器皿需經(jīng)高壓蒸汽滅菌鍋121℃下滅菌15 min。發(fā)酵用的麥芽培養(yǎng)液的配置方法相似，不加瓊脂即可，需在使用當(dāng)天提前配置。

負(fù)蝗腸道菌的分離：將負(fù)蝗饑餓處理24 h后，在無(wú)菌超凈臺(tái)上操作，用體積分?jǐn)?shù)為70%酒精表面消毒2 min，無(wú)菌水漂洗3次，用無(wú)菌解剖刀和無(wú)菌鑷子解剖出負(fù)蝗腸道，放在無(wú)菌研缽中加入2 mL無(wú)菌水研磨均勻，取0.2 mL稀釋液涂布于麥芽培養(yǎng)基平板表面，平行涂布三皿，待稀釋液充分被吸收后，在28℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)3～4 d至腸道菌充分生長(zhǎng)。

腸道菌的發(fā)酵：挑選菌株長(zhǎng)勢(shì)良好一皿，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)操作，用解剖刀在布滿(mǎn)腸道菌的培養(yǎng)板上劃上多條橫豎線(xiàn)，然后將培養(yǎng)基挖塊接種到2～3瓶裝有150 mL麥芽培養(yǎng)液的錐形瓶中，置于溫度為28 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床中培養(yǎng)7 d（若沒(méi)有搖床，可以采用定時(shí)搖晃錐形瓶的方法）。將發(fā)酵液經(jīng)紗布過(guò)濾后便得到含該菌株代謝產(chǎn)物的菌液。

除草活性實(shí)驗(yàn)：采用培養(yǎng)皿生物分析法，取稗草種子放入含有少量蒸餾水的培養(yǎng)皿中，28℃的培養(yǎng)箱中催芽培養(yǎng)2～3 d至種子露白備用。取一片濾紙片放于培養(yǎng)皿中，加入5 mL的菌液，使濾紙片均勻浸透。然后在培養(yǎng)皿中放入根部露白但未有生長(zhǎng)長(zhǎng)度的15顆稗草種子，根部朝下放置浸潤(rùn)于菌液中。平行處理3次，另取5 mL的無(wú)菌蒸餾水代替菌液重復(fù)以上步驟做空白對(duì)照。再一起置于28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，測(cè)定根長(zhǎng)，求出菌液對(duì)稗草種子生長(zhǎng)的抑制率。

5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

負(fù)蝗腸道菌株的分離結(jié)果：實(shí)驗(yàn)從負(fù)蝗腸道中分離得到的菌株其菌落在28℃時(shí)的麥芽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)很快，在4 d內(nèi)能都覆蓋整個(gè)平板（直徑9 am），顏色呈灰褐色或灰綠色。

除草活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果：是從對(duì)照組培養(yǎng)皿中隨機(jī)取出的一顆稗草種子，發(fā)現(xiàn)其根部長(zhǎng)勢(shì)良好，根長(zhǎng)為18.7 mm；從實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取出的稗草種子，其根部未生長(zhǎng)，仍處于剛露白的狀態(tài)。通過(guò)測(cè)量所有種子的根長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的45顆種子，只有少數(shù)幾顆有生長(zhǎng)，平均每顆根長(zhǎng)為0.7 mm，而對(duì)照組稗草種子的平均根長(zhǎng)為19.3 mm，此次實(shí)驗(yàn)中負(fù)蝗腸道菌菌液對(duì)稗草生長(zhǎng)的抑制率為96.4%。

6、結(jié)論

已有研究表明，一些以植物為食的昆蟲(chóng)其體內(nèi)的腸道菌能合成一定的植物毒素，殺死植物以利于昆蟲(chóng)消化。而本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，經(jīng)液體發(fā)酵后負(fù)蝗腸道菌的菌液能顯著抑制稗草種子生長(zhǎng)，抑制率達(dá)到97.3%。分析其主要原因應(yīng)是文獻(xiàn)中所述的含有根匍柄菌素等除草活性物質(zhì)，從而表明負(fù)蝗和其腸道菌確實(shí)存在著互利共生的關(guān)系。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，學(xué)生在提高實(shí)驗(yàn)操作技能和探究能力以及深入理解種間關(guān)系的同時(shí)，還能進(jìn)一步思考在當(dāng)今化學(xué)合成除草劑遇到研發(fā)率低且對(duì)人類(lèi)生存環(huán)境帶來(lái)破壞的背景下，是否可從昆蟲(chóng)腸道微生物中探尋天然除草劑的蹤跡，實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境的綠色無(wú)污染目標(biāo)。