甜蕎子粒總黃酮提取工藝的優(yōu)化

摘要：為了充分利用蕎麥（Fagopyrum esculentum）資源，以內(nèi)蒙古甜蕎子粒為研究對(duì)象，利用乙醇提取法提取子粒中總黃酮，并對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu)化。最終得出蕎麥子粒總黃酮提取的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，水浴時(shí)間80 min，水浴溫度60 ℃，料液比1∶20（m/V，g∶mL）。

關(guān)鍵詞：蕎麥（Fagopyrum esculentum）子粒；總黃酮；蘆丁；提取

中圖分類號(hào)：TS201.1；S517 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）02-0412-03

蕎麥（Fagopyrum esculentum）又名三角麥，是一種藥食兼可的蓼科雙子葉植物。有研究發(fā)現(xiàn)，蕎麥具有獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，不僅富含包括賴氨酸在內(nèi)的人體必需的8種氨基酸，而且富含油酸、亞油酸以及硒、鎂、鈣、鋅等礦物元素和VB1、VB2、VPP等維生素[1]。此外，它還能有效地降低糖尿病、高血壓病和心血管病等“富貴病”的發(fā)病率，而發(fā)揮這些藥理活性的物質(zhì)主要是蕎麥中所含的黃酮類化合物[2]。其藥理作用主要體現(xiàn)在消炎、抗病毒、抗腫瘤[3，4]，抗心肌缺血和心律失常[5，6]，抗自由基能力強(qiáng)[7]，鎮(zhèn)痛效果好[3]，具有激素的興奮和抑制的雙重效應(yīng)[8]等方面。

由于蕎麥具有良好的保健和醫(yī)用效果，目前中國(guó)對(duì)蕎麥的綜合開(kāi)發(fā)研究也方興未艾。由于苦蕎的總黃酮含量高于甜蕎，國(guó)內(nèi)的多數(shù)研究集中于苦蕎。雖然甜蕎的營(yíng)養(yǎng)成分較苦蕎略低，但是它在中國(guó)的分布更為廣泛，特別是內(nèi)蒙古是中國(guó)蕎麥的主要產(chǎn)區(qū)之一，有著非常好的地域和資源優(yōu)勢(shì)。基于此，研究以內(nèi)蒙古特有蕎麥為試驗(yàn)材料，確定其總黃酮提取的優(yōu)化工藝條件，以期為充分開(kāi)發(fā)利用內(nèi)蒙古的蕎麥資源提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 蕎麥來(lái)源于內(nèi)蒙古烏蘭察布市四子王旗蕎麥農(nóng)家。

1.1.2 儀器 722N可見(jiàn)光分光光度計(jì)購(gòu)自上海精密科學(xué)儀器有限公司，數(shù)顯恒溫水浴鍋購(gòu)自常州國(guó)華電器有限公司，F(xiàn)W80型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)購(gòu)自上海圣啟儀器儀表有限公司，鼓風(fēng)烘干箱購(gòu)自寧波機(jī)電工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，HS·Z68·20型電熱蒸餾水器購(gòu)自北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.1.3 藥品與試劑 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品購(gòu)于北京藥品生物制品檢定所；無(wú)水乙醇為分析純；50 g/L NaNO2、10 g/L AlCl3、100 g/L Al（NO3）3、10 g/L和40 g/L NaOH、1%鹽酸，以上試劑均為分析純用去離子水按常規(guī)方法配制。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取經(jīng)110 ℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品0.010 0 g，用65%的乙醇定容于50 mL容量瓶中，配制成0.2 mg/mL的黃酮類化合物的標(biāo)準(zhǔn)液。分別取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL于10 mL量筒中，然后用65%的乙醇定容至刻度線處。再將各量筒中不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行如下操作：分別取1 mL于試管中，加65%的乙醇1.5 mL，再加入50 g/L NaNO2溶液0.5 mL，搖勻靜置6 min后，加0.5 mL 100 g/L Al（NO3）3，搖勻后靜置6 min，再加入2 mL 40 g/L NaOH溶液，搖勻后靜置10 min，用722N可見(jiàn)光分光光度計(jì)于510 nm處測(cè)定不同濃度下的吸光度。最后根據(jù)測(cè)得的吸光度與濃度的關(guān)系繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可得回歸方程式：y=2.386 9x-0.009 1（r=0.991 8）。其中，x為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品的濃度（mg/mL）；y為于510 nm處測(cè)得的吸光度。總黃酮提取率的計(jì)算式：

總黃酮提取率=X×V/（W×1 000）×100%

式中，X為樣品中總黃酮的濃度，mg/mL；V為樣品體積，mL；W為樣品的質(zhì)量，g。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

1）乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響。分別將1.0 g粉碎的蕎麥子粒放入9個(gè)錐形瓶中，然后分別用30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%的乙醇浸提，料液比為1∶50（m/V，g∶mL，下同），于55 ℃恒溫水浴鍋水浴80 min，確定不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)總黃酮提取率的影響。

2）料液比對(duì)總黃酮提取率的影響。在水浴時(shí)間為80 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，水浴溫度為55 ℃，且水浴兩次的條件下，分別用料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶35、1∶40、1∶50和1∶60的溶液浸提，確定不同料液比對(duì)總黃酮提取率的影響。

3）水浴溫度對(duì)總黃酮提取率的影響。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，水浴時(shí)間為80 min，料液比為1∶40，水浴兩次的條件下，分別于40、50、55、60、65、70、75和80 ℃下浸提，確定不同水浴溫度對(duì)總黃酮提取率的影響。

4）水浴時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響。在料液比為1∶40，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，水浴溫度為55 ℃，水浴兩次的條件下，對(duì)樣品分別浸提50、60、70、80、90和100 min，確定不同水浴時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以影響蕎麥中總黃酮提取率的水浴溫度、料液比、水浴時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)4個(gè)影響因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，采用L9（34）正交表安排試驗(yàn)，試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

正交試驗(yàn)過(guò)程中，每個(gè)方案中取樣均為1.0 g，置于錐形瓶中，用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇于不同溫度下進(jìn)行恒溫水浴。試驗(yàn)條件按表1設(shè)計(jì)進(jìn)行，水浴后的濾渣用相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗滌，用量及水浴時(shí)間與之前相同（即進(jìn)行兩次水浴）。將兩次的濾液合并后，用索式提取裝置于98 ℃下恒溫蒸餾提取分離黃酮類化合物。最后將提取液用65%的乙醇定容至100 mL，用722N可見(jiàn)光分光光度計(jì)于510 nm處測(cè)定吸光度（相同條件同一批次平行處理4份，即每組測(cè)4個(gè)吸光度，最后取平均值）。

2 結(jié)果與分析

2.1 提純液成分定性分析結(jié)果

取提取液少許分別放入4支試管中，并標(biāo)記試管為①、②、③、④，然后分別加入1%鹽酸、10 g/L AlCl3、100 g/L Al（NO3）3和10 g/L NaOH溶液2～3滴，觀察試驗(yàn)現(xiàn)象。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，①中剛加入鹽酸時(shí)呈現(xiàn)灰白色，靜置數(shù)分鐘后現(xiàn)象不明顯，與加試劑前無(wú)明顯區(qū)別。若改加濃鹽酸，顯桃紅色。②中加入AlCl3后變?yōu)榱咙S色，靜置數(shù)分鐘后無(wú)變化。③中加入Al（NO3）3后變?yōu)闇\黃色，靜置數(shù)分鐘后無(wú)變化。④中加入NaOH后變?yōu)樽攸S色，靜置數(shù)分鐘后無(wú)變化。

由試驗(yàn)現(xiàn)象可以判斷出提取液中含有黃酮（由①知）、黃酮醇（由②、③知）及黃酮醇類（由④知）等黃酮類化合物。在4種試劑中，AlCl3的反應(yīng)靈敏，顏色變化顯著，其原因是鋁鹽可以與黃酮類化合物反應(yīng)生成亮黃色液體。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響 由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，提取率呈先增加后逐步減少的趨勢(shì)。這主要是在選擇溶劑時(shí)，單獨(dú)以水作為萃取溶劑時(shí)得到的提取液中礦物質(zhì)、糖類及一些水溶性蛋白質(zhì)雜質(zhì)較多，而以無(wú)水乙醇萃取總黃酮會(huì)帶入色素及脂溶性物質(zhì)。若利用乙醇-水體系作為萃取溶劑則可以彌補(bǔ)兩者的不足，調(diào)整乙醇水溶液的體積分?jǐn)?shù)為70%左右時(shí)提取率達(dá)最高。

2.2.2 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響 料液比是影響總黃酮提取率的一個(gè)重要參數(shù)，特別是一些浸潤(rùn)產(chǎn)生膨脹的母體，必須保證樣品被浸潤(rùn)且有一定的裕度。由圖3可知，隨著料液比的減小，總黃酮提取率有所增加，在1∶40～1∶20范圍內(nèi)提取率增加的速度較快，而在1∶60～1∶40范圍內(nèi)總黃酮提取率的增加明顯緩慢。從提高提取效果、減少溶劑用量和降低濃縮負(fù)荷等方面綜合考慮，料液比為1∶40～1∶20較合適。

2.2.3 水浴溫度對(duì)總黃酮提取率的影響 由圖4可知，隨著水浴溫度升高，黃酮類化合物在乙醇中的溶解度增加，同時(shí)由于水浴溫度的升高，提取液黏度減小，擴(kuò)散系數(shù)增加，促使提取速度加快，但當(dāng)水浴溫度達(dá)到70 ℃后提取率就不再增加，此后隨著水浴溫度的升高提取率略有下降，可能是由于水浴溫度過(guò)高，使得黃酮類化合物的活性結(jié)構(gòu)遭到破壞。另外，水浴溫度過(guò)高會(huì)使得雜質(zhì)的溶出量增加，給后續(xù)的分離操作帶來(lái)不便，同時(shí)也會(huì)造成溶劑損失，增大成本費(fèi)用。綜合考慮，水浴溫度選為60～70 ℃較合適。

2.2.4 水浴時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響 由圖5可知，隨著水浴時(shí)間的增加，總黃酮提取率也隨著增大。90 min后有下降趨勢(shì)，主要原因是水浴時(shí)間的增大，為目標(biāo)成分在溶劑與物料之間的分配爭(zhēng)取了有利的時(shí)間，提高了提取率，但水浴時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，特別是在高溫條件下，會(huì)導(dǎo)致黃酮類化合物的分解。綜合各方面考慮，水浴時(shí)間選為80～90 min較合適。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2的極差R值可知，4個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率的影響為C>B>D>A，也就是說(shuō)，在正交試驗(yàn)中，對(duì)總黃酮提取率影響最大的因素是乙醇體積分?jǐn)?shù)，其次是水浴時(shí)間、料液比，水浴溫度對(duì)結(jié)果影響最小。同時(shí)由方差分析結(jié)果可知，A、B、C、D對(duì)結(jié)果影響均不顯著。通過(guò)均值可以確定試驗(yàn)中因素的最佳組合為A2B1C2D1，即水浴溫度為60 ℃，水浴時(shí)間為80 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，料液比為1∶20，此條件即為最佳條件。

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)以蕎麥子粒為材料，以掌握蕎麥子粒中總黃酮的性質(zhì)、提取工藝為主要目的，以影響蕎麥子粒總黃酮提取率的因素為設(shè)計(jì)前提，對(duì)乙醇提取蕎麥子粒中總黃酮的工藝進(jìn)行了研究。楊芙蓮等[9]對(duì)甜蕎麥莖中類黃酮的提取研究表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%～80%、料液比為1∶40～1∶20、溫度為70～80 ℃、水浴時(shí)間選定為4 h時(shí)適合對(duì)類黃酮的提取。郭玉蓉等[10]采用正交設(shè)計(jì)對(duì)蕎麥黃酮提取工藝條件進(jìn)行篩選，得到蕎麥的最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、料液比1∶15、在50～55℃下提取6 h，此條件下苦蕎麥粉黃酮得率最高為2.5%。其結(jié)果與本試驗(yàn)不盡一致，其原因可能是試驗(yàn)過(guò)程中的誤差引起的，另外試驗(yàn)所取的材料的不同也將導(dǎo)致結(jié)果有差異。

總之，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的分析，得出甜蕎總黃酮提取的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，水浴時(shí)間80 min，水浴溫度60 ℃，料液比1∶20。

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