化州不同產區化橘紅道地性差異HPLC分析

摘要：以柚皮苷作標準品，采用HPLC法測定產自化州境內平定、寶山和和化等地化橘紅（Exocarpium Citrus Grandis）黃酮含量，通過分析化橘紅中黃酮成分HPLC圖譜的差異性，分析各地化橘紅道地性差異。結果表明，各地化橘紅黃酮含量分別為寶山11.0%±1.5%、和化9.8%±2.0%、平定10.8%±1.8%，各地化橘紅黃酮含量差異不顯著，但化橘紅黃酮成分HPLC圖譜存在明顯差異。

關鍵詞：化橘紅（Exocarpium Citrus Grandis）；黃酮；道地性；HPLC

中圖分類號：O657.7；R284 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）02-0428-02

道地化橘紅（Exocarpium Citrus Grandis）為產于廣東化州的毛橘紅，是蕓香科植物化州柚[Citrus grandis（L.） Osbeck var. tomentosa Hort.]的未成熟或近成熟干燥外層果皮，具有散寒、燥濕、利氣、消痰作用[1]。近年由于道地化橘紅身價高漲，化州大力發展橘紅生產，盡管民間有“寶山毛橘紅最道地”的說法[2]，然而化州境內不同區域所產化橘紅是否具有同樣的道地性，尚需進行科學分析和驗證。

道地與非道地中藥材的區別在于其藥效成分組成的差別。一些學者采用HPLC[3-5]、紅外[6]化學指紋圖譜方法，建立了毛橘紅道地性化學指紋圖譜，為區分毛橘紅與光橘紅提供了重要參考依據。中藥材藥效成分與其生長環境有關，林勵等[5]對毛橘紅與光橘紅化學指紋圖譜的研究表明，毛橘紅藥效成分的特殊性與其土壤成分的特殊性有關。生長環境發生變化，中藥材的藥效成分也會發生變化，其道地性也就發生了變化。例如：王蓮婧等[7]將化州毛橘紅移植于廣東英德，發現其外觀沒有差別，但藥效成分含量卻發生了變化。

化州總面積2 360 km2，南北距80 km，各鄉鎮區域在地形、生態和土壤環境方面存在明顯差異。黃酮是化橘紅主要藥效成分[8，9]，化橘紅的道地性與黃酮含量、組成密切相關。本試驗針對產自化州市內3個不同區域毛橘紅，通過HPLC法測定其黃酮含量，比較化州不同區域化橘紅藥效成分的差別，為區分化州市不同產地化橘紅道地性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

化橘紅樣品分別采于化州市平定、寶山、和化的橘紅種植園；樣品采集后80 ℃干燥2 h，粉碎備用。

柚皮苷標準品購于中國藥品生物制品檢定所（批號110722）。

色譜純甲醇，醋酸，無水乙醇；石油醚；乙醚等均為分析純試劑。

1.2 儀器

2690高效液相色譜儀（Waters，美國），101-2電熱干燥機（金壇市科技儀器有限公司），B323S電子天平（北京塞多利斯儀器系統有限公司）；HH數顯恒溫水浴鍋（金壇市金城國勝試驗儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 橘紅黃酮標準曲線的制作 精確稱取80 ℃干燥至恒重的柚皮苷對照品3.0 mg，甲醇溶解后定容至25 mL，配成0.12 mg/mL柚皮苷對照品溶液。分別準確吸取對照品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0和3.0 mL于10.0 mL容量瓶中，甲醇定容，混勻，待用。分別準確吸取各對照品溶液20.0 μL進行HPLC分析，以對照品濃度為橫坐標（x）、HPLC峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線。對檢測橘紅黃酮HPLC法的穩定性、精密度、可重復性、加樣回收率等指標進行測定和計算。

1.3.2 橘紅黃酮樣品溶液的制備 稱取已干燥至恒重的橘紅樣品0.5 g，濾紙包裹置索氏提取器中，加石油醚100 mL，水浴回流4 h，除去石油醚并揮干后，加乙醇50 mL，水浴回流2 h，過濾，收集濾液，樣品再加50 mL乙醇回流2 h，同法收集濾液，合并濾液并轉移至100 mL容量瓶中，以少量乙醇數次洗滌容器及濾紙，收集洗滌液，乙醇定容，置于5 ℃，待用。

1.3.3 色譜分析條件 SHIM-ODS（6.0 mm×150 mm，5 μm）色譜柱，流動相為甲醇-醋酸-水（95∶0.5∶4.5，體積比，下同），檢測波長為283 nm，進樣量設為20 μL，流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃。

2 結果與分析

2.1 標準曲線回歸方程

按照1.3.1方法測定柚皮苷對照品濃度，繪制標準曲線見圖1。

2.2 方法學考察結果

2.2.1 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、12、24 h進樣檢測，其峰面積RSD為2.9%，表明供試品溶液24 h內穩定。

2.2.2 精密度試驗 取同一供試品溶液，連續進樣5次，其峰面積RSD為2.6%，表明檢測精密度良好。

2.2.3 重現性試驗 取同一樣品5份，按上述方法制備供試品溶液并進行檢測，考察各色譜峰面積值的一致性，其峰面積RSD為3.3%，表明該法有良好的重現性。

2.2.4 加樣回收率測定 取已知柚皮苷含量的樣品溶液10.0 mL，分別加入濃度已知的柚皮苷標準品溶液1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL，測定其中柚皮苷含量，其平均回收率為99.8%，RSD為1.98%（n=5）。表明回收率高，準確度好。

2.3 樣品含量

所有測定都設3個平行，各化橘紅樣品中黃酮含量測定結果如下：寶山11.0%±1.5%，和化9.8%±2.0%，平定10.8%±1.8%。經單因素方差分析，在F測驗顯著的基礎上進行Duncan’s多重比較，結果表明各地化橘紅樣品的黃酮含量差異不顯著。

2.4 HPLC圖譜分析

由圖2可知，各產區化橘紅的HPLC圖譜（圖2B，圖2C和圖2D）均出現了3個保留時間相近的峰，并且第1峰的保留時間都與柚皮苷標準品相近（圖2A）。就3峰的峰高順序看，和化橘紅為高-中-低（圖2B），寶山橘紅為高-低-中（圖2C），平定橘紅為低-高-高（圖2D），其峰高構成差異顯著，該結果表明，3個區域的毛橘紅化學成分存在明顯差異。中藥的道地性藥性不僅取決于其藥效成分的種類和數量，還與不同藥效成分的構成比例有密切關系。產于化州境內不同生態區域的3個化橘紅樣品HPLC圖譜分析結果表明，各地化橘紅藥效成分構成比例存在差異，即其道地性上也存在一定差別。

3 結論與討論

本研究初步建立了HPLC法測定化橘紅中黃酮含量的方法。以柚皮苷為標準品，甲醇-醋酸-水（95∶0.8∶4.2）為流動相，檢測波長283 nm，進樣量20 μL，流速1.0 mL/min，該方法測定化橘紅黃酮含量簡便、準確度高。用該法測得化州境內不同區域橘紅的黃酮含量分別為寶山11.0%±1.5%、和化9.8%±2.0%、平定10.8%±1.8%，統計結果表明各地的化橘紅樣品黃酮含量差異不顯著。HPLC圖譜分析表明，化州境內3區域出產的化橘紅黃酮成分構成存在明顯差異，并由此推論其道地性存在差異。

從研究結果看，同是產于化州境內不同地域的化橘紅，其黃酮含量沒有明顯差別，但黃酮化合物組成存在明顯差別。黃酮是化橘紅重要的藥效成分之一，藥效成分是重要道地性的基礎，因此可以推斷不同區域化橘紅的道地性存在差異。該結果對于化州境內任一區域化橘紅都具有同樣道地性提出了質疑，但該結果尚需對區域、樣品成分和化橘紅藥效關聯性方面的深入研究，以明確化州境內道地化橘紅的具體區域，這將對指導發展道地化橘紅栽培提供科學參考。

參考文獻：

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