水稻紋枯病菌拮抗細菌的分離與篩選

摘要：從河南省信陽市水稻種植區土壤及水稻根、莖、葉等組織中分離得到1 248株細菌，經對峙培養法篩選出對水稻紋枯病菌（Riziocotinia solani）有強拮抗作用的菌株5株，分別為DJH-15、SQC-42、SQC-09、XX-19和YH-23。其中，DJH-15菌株的抑菌帶最寬，達21.6 mm，其代謝產物抑菌率達78.8%。結果表明DJH-15防治水稻紋枯病具有較大應用潛力，待進一步研究開發。

關鍵詞：水稻紋枯病菌（Riziocotinia solani）；拮抗細菌；篩選

中圖分類號：S435 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）01-0077-02

水稻紋枯?。ú≡鶵iziocotinia solani）是河南省信陽市水稻生產中的主要病害之一，該病在信陽地區每年都有不同程度的發生。調查結果表明，在2003～2005年該病的發病田塊幾乎達到100%，發病程度表現為中、輕度，造成6%～10%的產量損失，成為該地區水稻穩產、高產的嚴重障礙[1]。目前，在生產上主要用井岡霉素等藥劑來防治該病，但長期使用導致紋枯病菌產生抗藥性[2]、造成環境污染和危害人類健康等問題，越來越引起人們的關注。利用拮抗細菌防治植物病害可以達到以菌制菌的目的[3，4]，表現出良好的應用前景，當前已成為熱點研究領域之一。本試驗從不同樣品中分離篩選拮抗細菌，以期為水稻紋枯病菌的生物防治提供切實可行的方法與理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

從信陽息縣、二十里河、三橋村等地的水稻田中采集健康水稻根、莖、葉和根際土壤樣品，共192份。

1.2 供試培養基

馬鈴薯浸汁培養基（PDA）；牛肉膏蛋白胨培養基（NA）；牛肉膏蛋白胨培養液（NB）[5]。

1.3 供試病原真菌

水稻紋枯病菌（Riziocotinia solani）由信陽農業高等?？茖W校植物病理學實驗室提供。

1.4 細菌分離與純化

稱取健康水稻植株樣品2.0 g并洗凈，剪斷成長2～3 mm片段，用去離子水漂洗3次后，將葉、莖和根分別置于盛有18 mL去離子水的100 mL三角瓶中，在搖床上以120 r/min振蕩10 min；稱取土樣10.0 g，加入裝有90 mL去離子水的250 mL三角瓶中，置搖床上以120 r/min振蕩30 min，靜置，即成10-1稀釋菌懸液，取上述菌懸液1 mL加入盛有9 mL去離子水的試管中，此為10-2稀釋菌懸液，依此類推，用去離子水稀釋成10-3～10-7菌懸液。分別取不同濃度菌懸液5 μL，依次涂布于NA培養基上，每個濃度重復3次，置于26 ℃恒溫箱中培養24 h后，挑取單菌落作為參試菌株。

1.5 細菌菌株拮抗作用測定

1.5.1 室內拮抗性測定 采用對峙培養法，即在平板中心接種直徑為5 mm的水稻紋枯病菌菌塊，在平板的4個角接種篩選菌株，對照不接種篩選菌株，放置27 ℃恒溫箱內培養72 h，測量各篩選菌株菌落邊緣和水稻紋枯病菌株菌落邊緣之間的抑菌帶寬度，同時觀察篩選菌株的菌落大小和生長速度，選出拮抗作用明顯的細菌菌株做進一步拮抗菌株試驗。

1.5.2 拮抗細菌代謝產物對供試病原菌的抑制作用 將初篩的拮抗細菌接種于NB培養液，28 ℃下振蕩培養3 d，發酵液8 000 r/min離心15 min，取上清液，重復3次，最后用孔徑0. 22 μm的濾膜過濾。將2 mL無菌濾液和20 mL NA培養基混合均勻倒入培養皿，冷卻凝固后，在每個培養皿中央接種直徑為5 mm的供試病原菌菌塊，27 ℃下培養24 h。以直接培養的水稻紋枯病菌作為對照。用垂直十字法分別測量在含測試菌發酵液條件下和不含發酵液條件下的病原菌菌塊直徑，以如下公式計算抑制率。

抑制率=■×100%

2 結果與分析

2.1 不同樣品中分離的細菌菌株與拮抗菌株

由表1可知，經過分離篩選共獲得細菌1 248株，其中具有拮抗作用的菌株215株，根據菌落的形態特征，將具強拮抗作用的16株菌株分為4個不同的類群?，F將具有較強拮抗作用的5株菌株對水稻病原菌的拮抗作用列入表2。在所分離的菌株中，根際土壤中的拮抗細菌分離率最高，達到22.4%；根部其次，為16.9%；葉片部、莖部較低，分別為11.7%、10.1%。

2.2 室內拮抗菌株的篩選

分離純化共得到細菌菌株1 248株，室內采用對峙培養法測定出215株細菌菌株可有效地抑制水稻紋枯病菌菌絲生長。抑菌帶寬度小于10.0 mm的有132株，10.0～15.0 mm的有78株，15.0～20.0 mm的有4株，在20 mm以上的有1株。其中水稻根際土壤中分離得到1株菌株抑菌效果最為理想。

2.3 5株代表性菌株代謝產物對水稻紋枯病的拮抗作用

將上述分離得到的5株代表性菌株的代謝產物對水稻紋枯病菌進行拮抗作用測定（表3），結果表明DJH-15菌株的抑制率最佳，達到78.8%，這與室內篩選中DJH-15的作用結果相一致。其他4株菌株的抑制率均超過60%，表明DJH-15菌株是1株非常具有潛力的菌株，可對其做進一步的研究與開發。

3 結論

目前，關于拮抗細菌分離篩選途徑的相關報道很多，鄭愛萍等[6]從健康的水稻植株、感染紋枯病水稻植株根系、莖、葉以及根際土壤、秧田水、菌核上分離得到能拮抗紋枯病的細菌；郝變青等[7]從漚肥浸漬液中分離篩選到對青椒枯萎病菌具有強烈抑制作用的蠟質芽孢桿菌；作者曾從稗草（Echinochloa crusgalli）根部成功篩選出稻瘟病拮抗菌株L1。本試驗從健康水稻根、莖、葉和根際土壤中分離192份樣品，篩選出對水稻紋枯病菌具有拮抗作用的菌株215株，其中具有較高拮抗作用的菌株5株。結果表明水稻根際土壤和水稻根部等組織中存在許多有益微生物，可做進一步研究與開發。

拮抗細菌的篩選通常是先在實驗室內的培養基平板上進行的，這就具有很大的局限性，并且工作量大、效率低，許多通過其他方式起作用的菌株容易被漏篩。如何發明一種高效的篩選方法值得每一位工作者思考。另外，王繼春等[8]和彭化賢等[9]認為在室內試驗中的抑菌帶寬度與其田間效果并不一定具有一致性，甚至會出現相反的情況。這表明單純的室內平板試驗還不足以確認出目標菌株，需要采用室內與室外相結合的方式進一步進行篩選，防止有益菌漏選。

本研究只對水稻紋枯病菌拮抗菌株進行室內分離和篩選，而DJH-15等菌株在離體葉片上和田間對水稻紋枯病的防治效果，對其他病原菌的拮抗作用，以及其發酵條件、定殖能力等方面有待進一步研究。

參考文獻：

[1] 張慶琛，王青林，馬漢云，等.信陽市水稻紋枯病發生與綜合防治[J].現代農業科技，2006（18）：38-39.

[2] 陳志誼，許志剛，高泰東，等.水稻紋枯病拮抗細菌的評價與利用[J].中國水稻科學，2000，14（2）：98-105.

[3] 林福呈，張炳欣，葛起新.枯草芽孢桿菌產生的拮抗物質對西瓜枯萎病菌孢子萌發的影響[J].浙江農業大學學報，1990，16（增刊2）：235-240.

[4] LIDEBAO. Biological control of plant disease with Bacillus spp[A]. TEWARI， K K， SINGHAL， G S. Plant Molecular Biology and Biotechnology[M]. New Delhi Narosa Publishing House， 1997.208-219.

[5] 方中達.植病研究方法[M].北京：中國農業出版社，1998.

[6] 鄭愛萍，李 平，王玲霞，等.水稻紋枯病拮抗細菌的篩選及抗生性研究[J].西南農業學報，2001，14（1）：78-81.

[7] 郝變青，馬利平，喬雄梧，等.拮抗細菌菌株BC98-I對青椒枯萎病菌的抑制作用[J].農藥學學報，2005，7（1）：35-39.

[8] 王繼春，任金平，韓潤婷，等.水稻病害生防細菌及其生物活性測定[J].吉林農業學報，2002，27（增刊）：41-43.

[9] 彭化賢，劉波微，何忠全，等.水稻稻瘟病拮抗細菌的分離和篩選[J].西南農業學報，1999，12（3）：85-88.