沙眼衣原體感染對精子凋亡的影響

摘要：目的：通過探討精液沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，CT）感染對精子凋亡的影響，為研究男性不育提供新思路。方法：1.沙眼衣原體的檢測：免疫層析法2.精子凋亡的檢測：常規細胞形態學染色（瑞-姬染色）、末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）介導的脫氧核苷酸原位末端標記法（TUNEL）結果：精液CT陽性組精子凋亡率33.03±14.98%，正常對照組精子凋亡率為9.68±2.78%，組間差異顯著（P<0.01），具有統計學意義，說明精液CT感染引起精子凋亡率增加；結論：精液沙眼衣原體（CT）感染導致精子凋亡率增加；表明沙眼衣原體感染是男性不育的重要原因之一。

關鍵詞：男性不育精子沙眼衣原體凋亡

中圖分類號：R-331文獻標識碼：A文章編號：（2013）03-0026-04

To Study about the effect of the chlamydia trachomatisTo Study about the effect of the chlamydia trachomatis infection on Sperm apoptosiss

ZHENG Li-hong（GuiYang Nursing Vocational College，Guiyang 550003，Guizhou）

Abstractt：Objective：To provide new ideas and develop new vision for clinical research and treatment about male infertility by explorating on the effect of CT infection on sperm apoptosis . Method：1. Detection of Chlamydia trachomatis：immunochromatography 2. Apoptosis Detection：Terminal deoxynucleotidyl transferase enzyme （TdT）-Road deoxynucleotidyl in situ end labeling （TUNEL）. Results：Sperm apoptosis rates were 33.03±14.98%and 9.68±2.78% in CT infection group and normal fertility group respectively； There was dramatically difference between two groups （P <0.01） ；Results showed that the CT infection of semen caused sperm apoptotic rate’s increase. Conclusions：Chlamydia trachomatis （CT） infection of the semen leads to increase the number of sperm apoptotic rate. Results showed that CT infection is one of the most important of the male infertility.

Key wordss：male infertility； Sperm Chlamydia trachomatis ； apoptosis

精子的產生、成熟及輸送是個復雜的過程，任何一個環節的異常對精子受精均有影響，最終影響男性的生育力。男性生殖道的感染是引起男性不育一個非常重要的因素。在癥狀和非癥狀男性生殖道感染中，起關鍵作用的兩種生物體是解脲支原體（mycoplasma urealytium；MU）和沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis；CT）。近年來，關于解脲支原體感染與男性不育的關系已有大量的報道，但沙眼衣原體感染對精子及男性不育有何影響見諸報道不多[1-3]，CT感染引起男性不育的機制仍不清楚。據WHO報道每年全球約5億人新發性傳播疾病，其中的18%是由CT感染造成[4，5]。在女性中，年輕、性活躍者是生殖道CT感染的好發人群，妓女作為感染的“核心”人群，對CT的傳播起著重要作用；在男性中，泌尿生殖道CT感染率不易確定，其原因是CT感染不易作微生物學檢查或為無癥狀者。細胞凋亡（apoptosis）是細胞在胞外或胞內信號誘導下發生的主動自殺死亡過程，是調控機體發育，維護內環境穩定，由基因控制的細胞主動死亡過程。關于精子凋亡與男性不育的關系已有報道[6]。因此，本課題為明確沙眼衣原體感染引起男性不育的機制，于2012-2013年進行了精液沙眼衣原體感染對精子凋亡的影響進行了有益探索。

1材料與方法

1.1研究對象

正常對照組15例，有正常生育史，身體健康，精液沙眼衣原體檢測陰性。精液常規正常的自愿捐精子者，年齡24-32歲，平均年齡27.73±2.20歲。

CT陽性組57例，來自于我院不育門診，為婚后同居2年以上，有正常性生活，未采用任何避孕措施，睪丸、附睪、內分泌、染色體等檢查無異常；精液沙眼衣原體檢測陽性，年齡24-40歲，平均年齡28.81±3.31歲，不育年限2-10年，平均4.37±2.70年，其配偶檢查無異常。

1.2試劑

TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒由南京凱基生物技術有限公司提供。沙眼衣原體（CT）快速免疫檢測試劑盒由英國Unipath公司提供。1×Earle’s和10×Earle’s液由Sigma公司提供。percoll原液由南京凱基生物技術有限公司提供。TritonX-100由北京拜爾迪生物公司提供。

1.3研究方法

所有研究對象均禁欲3-5天，手淫法收集全程精液于無菌玻璃容器中，置于35℃恒溫恒濕箱中待其液化。取液化后的精液2ml加入底部有2ml45% Percoll液的離心管中，2000r/min，離心10min，精液細胞主要沉積于精漿和45%Percoll液之間，于精漿與45%Percoll液之間用移液器取50ul×5次精液沉淀入另一組離心管中，加入2ml生理鹽水，充分混勻，1500r/min，離心10min，棄上清，加入生理鹽水2ml，充分混勻后，1500r/min，離心10min，棄上清，加入生理鹽水2ml，充分混勻后，1500r/min，離心10min，棄上清，加入3min生理鹽水，充分混勻，配成一定濃度的細胞懸液。取制備好的精液細胞懸液50ul滴加多聚賴氨酸放脫玻片（TUNEL時用）上，用采血針推平，棄去多余的細胞懸液，平放在干凈的桌面上，自然涼干。

1.4沙眼衣原體檢測

嚴格按照試劑盒說明書進行操作，方法為免疫層析法。

1.5TdT介導的TUNEL法檢測凋亡精子

取已制備好的多聚賴氨酸放脫玻片精液細胞樣本浸入固定液，室溫（15-25℃）固定15-30min-1h；-20℃的乙醇中放置2h；PBS漂洗3次，每次5min（下同）；浸入封閉液，室溫（15-25℃）封閉10min；PBS漂洗3次，每次5min；浸入通透液中，冰上（2-8℃）促滲2min。PBS漂洗兩次，樣本周圍用吸水紙吸干；每個樣本滴加50ulTdT酶反應液，加蓋玻片37℃避光濕潤反應60min；PBS漂洗3次，樣本周圍用吸水紙吸干；滴加50ul Streptavidin-HRP-工作液，加蓋玻片37℃濕潤避光反應30min；PBS漂洗3次；滴加50ul DAB工作液，室溫顯色反應10min；PBS漂洗3次，光學顯微鏡下檢測及拍照。

1.6統計學處理采用SPSS12.0統計軟件包進行χ2檢驗。結果用x（_）±s表示。

2結果

2.1正常對照組15例，CT陽性組共57例，每例隨機觀察精子頭尾部，計數凋亡精子，統計精子凋亡率（計數500個精子，計算凋亡精子數占總精子數的比例），其中正常對照組精子凋亡率為9.68±2.78%；CT陽性組精子凋亡率達到33.03±14.98%。

2.2TdT介導的TUNEL法檢查凋亡精子

TdT介導的TUNEL法是檢測凋亡細胞的常用方法。本課題運用TdT介導的TUNEL法對正常對照組和CT陽性組精液標本進行處理后，隨機觀察正常對照組和CT陽性組精液標本，凋亡精子頭部呈棕黃色（圖1、圖2），而未凋亡精子未著色。

3討論

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，CT）是一類專性細胞內生長、有獨特發育周期的原核細胞型微生物，很少從正常男性尿道中分離出來，但被認為是非淋菌性尿道炎（NGH）、附睪炎和慢性前列腺炎的主要病因之一，因此其對男性生育的影響引起了人們的關注。本課題研究結果顯示CT陽性組和正常對照組精子凋亡率分別為33.03±14.98%和9.68±2.78%，組間差異顯著（P<0.01），具有統計學意義，說明精液CT感染導致精子凋亡率增加。精液沙眼衣原體感染引起精子凋亡增多的可能機制是：CT感染可刺激巨噬細胞分泌IL-1、LI-6、TNF-α等細胞因子〔7，8〕，而TNF-α是啟動細胞凋亡的重要細胞因子；同時TNF-α增高后使轉移單電子的還原型輔酶Ⅱ氧化酶含量增多，可產生一系列的活性氧化物質（ROS），過量的ROS一方面可使精子線粒體內、外膜上的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，使膜的脂質排列松散，內膜脊減少，使ATP合成降低；另一方面過量ROS還可引起精子核的DNA發生斷裂，從而導致精子凋亡的增加。Darville等〔9〕研究有關小鼠生殖道抗CT感染機制，結果表明在抗CT感染的宿主免疫應答中存在細胞介導免疫。Spadafora〔10〕研究證實生精細胞通過CD4分子介導免疫后，具有自發攝取外源性DNA能力，精子與外源性DNA相互作用的刺激內源性核酸導致類似凋亡的細胞死亡過程。

細胞凋亡（apoptosis）是多細胞生物普遍存在的細胞死亡形式之一；有研究顯示：在生長發育、組織代謝和一些疾病等許多生理和病理過程中，凋亡都發揮著極為重要的作用。目前檢測凋亡的方法很多，其中原位末端標記技術—TUNEL法是分子生物學與形態學相結合的研究方法，可對完整的單個凋亡細胞或凋亡小體進行原位染色，能準確反映細胞凋亡最典型的生物化學和形態特征。DNA裂解為許多單或寡核苷酸片斷是細胞凋亡的主要生化標志。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，很少能夠被染色〔11〕。本課題應用TdT介導的TUNEL法檢測正常對照組和CT陽性組精液標本，結果發現凋亡精子呈棕黃色，而未凋亡精子不著色。

綜上所述，本課題研究表明精液CT感染導致了精子凋亡率增加，進一步證實了精液沙眼衣原體（CT）感染是導致男性不育的重要原因之一。

參考文獻

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