槭樹葉片類黃酮糖基轉移酶基因RT—PCR擴增體系優化

摘 要：以槭樹“秋天火焰”變色期秋季葉片為試材，采用改良CTAB法提取葉片總RNA，利用GenBank中相關物種的UFGT基因序列設計特異引物，進行RT-PCR擴增并對RT-PCR反應體系中的引物、退火溫度和循環次數進行優化，建立了槭樹葉片UFGT基因的RT-PCR擴增反應體系。

關鍵詞：槭樹；UFGT；RT-PCR

中圖分類號：Q781文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）03-0001-04

彩葉樹種的葉色表達是遺傳因素和外部環境（光照、溫度、水分和礦物質營養）共同作用的結果，二者通過改變樹種葉片中各種色素的種類、含量以及分布形成了多彩的葉片。彩葉樹種葉片呈現彩色的直接原因就是葉片中的色素種類和比例發生了變化。類黃酮糖基轉移酶（UDP glucose-flavonoid-3-o-glycosyltranferase，UFGT） 是花青苷合成途徑的最后一個酶，它使不穩定的花青素轉變成穩定的花青苷[1]，并且該酶催化多種花青苷，甚至可以催化黃酮醇的糖苷化。Boss等以黑色果皮的Shiraz葡萄品種的幾種不同組織為試材，檢測花青苷生物合成的幾個相關基因的表達情況，發現只有UFGT基因在果皮上特異表達，而其它的基因在各組織中均有表達；UFGT基因在有色葡萄中表達，而在白葡萄皮中不表達，說明UFGT基因是葡萄皮著色的關鍵基因[2，3]。

槭樹是重要的秋季色葉樹種，在世界各地園林景觀中廣泛應用。目前對其研究主要集中在栽培[4]、酶活性[5]、光合日變化[6，7]等方面，關于槭樹葉色表達相關基因克隆方面的研究則較少。本研究以槭樹秋季葉片為試材，對擴增UFGT基因的RT-PCR反應體系進行優化，從而建立起高效特異的槭樹葉片UFGT基因擴增PCR體系。

1 材料與方法1.1 材料

試驗于2011年11月在山東省果樹研究所進行，以槭樹品種“秋天火焰”（Acer×freemanii‘Autumn Blaze’）的秋季變色葉片為試材，采自山東省果樹研究所彩葉樹種種質資源圃。于11月份采集葉片，迅速放入液氮中冷凍，帶回實驗室放入-80℃冰箱中備用。1.2 試劑

CTAB、SDS、EDTA、NaCl、PVP、LiCl、DEPC、Tris堿、巰基乙醇、蛋白胨、酵母提取物、氨芐青霉素、瓊脂糖、瓊脂粉等為進口分析純試劑；異戊醇、氯仿、無水乙醇等為國產分析純試劑；PCR kit、cDNA kit；PCR引物合成由上海生工生物技術公司進行。玻璃器皿于180℃烘烤8 h，塑料制品等用0.1% DEPC水浸泡過夜后高壓滅菌。

由于RNA在RNA酶的作用下非常容易降解，RNA 提取中所用的溶液除Tris外，均用0.1% DEPC水處理并高壓滅菌，含Tris的溶液用經高壓滅菌的DEPC水直接配制。1.3 RT-PCR體系的建立

1.3.1 RNA提取及反轉錄 總RNA提取參考招雪晴等[8]的方法，采用改良CTAB法提取，將提取到的總RNA用cDNA反轉錄試劑盒進行反轉錄。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，采用Nanodrop紫外分光光度計測量OD值。

1.3.2 UFGT基因的引物設計 根據GenBank中（www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）登錄的相關物種的UFGT基因的保守序列設計6對簡并引物。

1.3.3 PCR 反應體系優化 （1）引物篩選：以反轉錄后的cDNA為模板，采用不同的引物進行PCR擴增，以篩選最佳引物。采用25 μl的反應體系：10×PCR buffer 2.5 μl，dNTP 2 μl，上下游引物各2 μl，cDNA 2 μl，Taq酶 0.2 μl，滅菌蒸餾水 14.3 μl。反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性40 s，56℃退火20 s， 72℃延伸20 s，35個循環；72℃保溫10 min。

（2）最佳退火溫度的確定：反應體系不變，采用篩選出的引物，設置不同的退火溫度（50、51、56、58、60、63、65℃）進行梯度PCR，以確定最佳的退火溫度。

（3）PCR反應體系的進一步優化：確定了最佳引物和最佳退火溫度后，通過縮短變性時間、減少循環次數等措施進一步對得到的PCR反應體系進行優化。

2 結果與分析2.1 總RNA的制備

利用改良的CTAB法提取槭樹葉片的RNA，如圖1所示，測量其OD值，結果為2.01，表明蛋白污染少；用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，28S、18S、5S條帶較清晰，沒有降解現象。說明所提取的RNA純度和完整性較好，無DNA污染，符合cDNA合成的要求。

2.3 PCR 反應體系優化

2.3.1 最佳篩選引物 對設計的6對引物進行常規PCR擴增，篩選最佳的引物序列。由圖2看出，引物1的條帶明顯，適宜進一步做體系優化。

1～6：引物1～6擴增條帶；7：內參基因Actin

圖2 “秋天火焰”6對引物電泳圖

2.3.2 確定退火溫度 分別設50、51、56、58、60、63、65℃ 7個退火溫度，將不同退火溫度的PCR 產物于1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測后發現： 當退火溫度為50℃和51℃時出現特異性條帶 （見圖3）。表明50℃和51℃均適合‘秋天火焰’槭樹UFGT基因PCR擴增。

圖3 “秋天火焰”槭樹葉片不同退火溫度的PCR電泳圖

2.3.3 PCR體系優化 將PCR反應循環中的變性時間縮短為30 s，循環次數改為30次，PCR檢測結果顯示，可得到UFGT基因片段的特異擴增條帶。此改進措施可使PCR反應時間節省30 min左右，反應效率提高。

3 結論與討論

PCR技術靈敏度高、特異性強、操作簡便，是現代分子生物學家必不可少的研究工具。PCR擴增引物的合理設計與PCR反應體系的建立是克隆基因片段或全長序列成功的關鍵。其中，PCR反應體系的組分以及Taq聚合酶、模板cDNA濃度、Mg2+濃度、變性劑等都是重要的影響因素[9]。3.1 反應模板

成功的cDNA合成來自高質量的RNA，因而，提取的總RNA質量對整個PCR反應有重要影響[10]。本試驗中，采用改良CTAB法提取的葉片總RNA質量較好，可作為槭樹葉片總RNA提取的常規方法。3.2 引物

PCR引物設計的好壞，是能否獲得高質量PCR產物的關鍵。設計的上游引物和下游引物必須與目的基因片段3′末端高度同源互補[11]。由于在GenBank中無法獲得槭樹UFGT基因的特異性引物，故以GenBank中登錄的梨[12]等UFGT基因為參考，依據保守區堿基序列設計簡并引物，然后進行PCR擴增。由于設計簡并引物堿基序列的不確定性，引物特異性會有所降低，使PCR擴增的難度加大，反應底物濃度以及其它條件都要摸索。最終篩選出引物1適合進行下一步的體系優化。

3.3 退火溫度

退火溫度是影響RT-PCR特異性的較重要因素，與引物的長度和G+C 的含量密切相關[13]。若溫度過高，設計引物與模板DNA 親和力較小，得不到擴增產物；溫度過低會引起非特異性擴增，因此，一般是在引物Tm值允許范圍內，選擇較高的退火溫度，這樣可提高RT-PCR反應的特異性。本研究結果表明，“秋天火焰”槭樹適宜的退火溫度是50℃和51℃。

3.4 循環次數

PCR循環次數決定PCR擴增程度，主要取決于模板DNA的濃度。一般選在30～40次之間，PCR循環次數越多，非特異性產物隨之增多。在試驗中，為提高PCR反應效率，30個循環便可達到較理想的擴增效果。

綜上所述，槭樹葉片UFGT基因的最佳PCR體系為：10×PCR buffer 2.5 μl，dNTP 2 μl，上下游引物各2 μl，Taq酶 0.2 μl，cDNA 2 μl，滅菌蒸餾水 14.3 μl。反應條件為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，51℃退火20 s，72℃延伸20 s，30個循環；72℃保溫10 min。

參 考 文 獻：

[1] Lister C E， Lancaster J E.Phenylalanine ammonialyase （PAL） activity and its relationship to anthocyanin and flavoniod levels in New Zealand-grown apple cultivars[J].Journal of the American Society for Horticulture Science， 1996，12（2）： 281-285.

[2] Boss P K，Davies C，Robinson S P.Analysis of the expression anthocyanin pathway genes in developing Vitis vinifera L.cv.Shiraz grape berries and the implications for pathway regulation[J].Plant Physiol.， 1996， 111： 1059-1066.

[3] Boss P K， Davies C， Robinson S P.（下轉第6頁）

山 東 農 業 科 學 2013，45（3）：4～6Shandong Agricultural Sciences

山 東 農 業 科 學第45卷第3期方志軍等：玉米器官大小相關基因SMO2的鑒定和特征分析

收稿日期：2012-09-21