不同葉齡菠菜葉片抗壞血酸含量與其代謝相關酶活性的比較

摘 要：以歐麗特菠菜葉片為試材，研究了菠菜葉片發育過程中3個時期葉片（幼葉、成熟葉、衰老葉）的抗壞血酸代謝變化及抗壞血酸含量與其相關酶活性的關系。結果表明：抗壞血酸（AsA）和氧化型抗壞血酸（DHA）含量的變化趨勢與L-半乳糖-1，4-內酯脫氫酶（GalLDH）以及脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）活性的變化趨勢基本一致，而與抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性變化呈此消彼長。同時單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）、谷胱甘肽還原酶（GR）和還原型谷胱甘肽（GSH）有助于AsA的再生。說明通過增加GalLDH和再生酶活性能提高菠菜葉片AsA的含量，并延緩其衰老。

關鍵詞：菠菜； 葉片； 抗壞血酸；循環； L-半乳糖-1，4-內酯脫氫酶

中圖分類號：S636.101文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）03-0064-04

抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）是植物和大多數動物體內合成的一類己糖內酯化合物，是大多數生物體內重要的抗氧化劑和許多酶的輔因子，在生長發育中起著重要作用（Noctor Foyer，1998）。在高等植物中，AsA除了通過AsA-GSH循環系統再生外，還可以自身合成。脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR） 、抗壞血酸過氧化物酶（APX）及谷胱甘肽還原酶（GR） 是參與AsA-GSH循環的主要酶。而L-半乳糖-1，4-內酯脫氫酶（GalLDH）是AsA自身合成主要途徑即L-半乳糖途徑中直接催化半乳糖內酯的關鍵酶。關于植物發育過程中AsA通過AsA-GSH循環再生及合成的研究，國內外系統報告尚少。本試驗以菠菜品種歐麗特的葉片為試材，探討了菠菜葉片發育過程中AsA-GSH循環及AsA合成關鍵酶GalLDH活性的變化，以明確菠菜葉片發育對抗壞血代謝的影響及抗壞血酸含量與其相關酶活性的關系，為調控菠菜的AsA含量的栽培和育種，延緩菠菜衰老提供理論依據。

1 材料與方法1.1 試驗材料

以菠菜歐麗特（Spinacia oleracea L.）葉片為試材，2012年3月下旬種植于聊城市農業科學研究院試驗基地，于4月下旬隨機采取菠菜發育過程中3個時期的葉片（幼葉為出苗后第30天，新長成的4片葉；成熟葉為出苗后第40天，由內向外第3～5片葉；衰老葉為出苗后第50天，由內向外第5～7片葉）若干，用液氮處理并保存于-80℃待用。每個樣品在田間分別隨機3點取樣。

1.2 測定指標及研究方法

1.2.1 還原型抗壞血酸（AsA）和氧化型抗壞血酸（DHA）測定 參考Turcsanyi等及Takahama和Oniki提供的方法并做適當改進[3，4]。

1.2.2 還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）測定 參考Michael等提供的方法。

1.2.3 L-半乳糖-1，4-內酯脫氫酶（GalLDH）活性的測定 參照Tabata等（2001）[5]的方法并做適當改進。1個酶活性單位定義為每分鐘氧化1 nmol L-半乳糖內酯（相當于還原2 nmol 細胞色素C）所需的酶液量，并把它換算用U/gFW表示。其中摩爾系數值為17.3 L/（mol·cm），用于酶活性計算。

1.2.4 DHAR、MDHAR和APX活性的測定 參考Stasolla和Yeung提供的方法[6]。DHAR 1個酶活性單位（U/gFW）定義為每克鮮重每分鐘還原1 μmol DHA；MDHAR 1個酶活性單位（U/gFW）定義為每克鮮重每分鐘氧化1 μmol NADH；APX 1個酶活性單位（U/gFW）定義為每克鮮重每分鐘氧化1 μmol AsA。

1.2.5 谷胱甘肽還原酶（GR）活性的測定 按Knorzer 等（1996）[7]的方法，這是基于NADPH 氧化后在340 nm 處的吸光度的減少來衡量酶活性大小的方法。

各項指標重復測定3次。

2 結果與分析

2.1 菠菜葉片發育過程中AsA、DHA、AsA+DHA含量和AsA/DHA比值的變化

由圖1可以看出，在幼葉、成熟葉和衰老葉中AsA、DHA和AsA+DHA含量差異顯著。AsA和AsA+DHA含量隨著葉片的發育逐漸升高，至葉片成熟后，隨葉片的衰老顯著降低，呈先升高后降低趨勢。而DHA含量在葉片發育進程中一直呈降低趨勢。

由圖2看出，菠菜葉片發育過程中AsA/DHA比值先升高后降低。在葉片成熟以前升高，成熟后隨著葉片的衰老AsA/DHA比值顯著降低。說明AsA氧化還原狀態與葉片的衰老密切相關。

2.2 菠菜葉片發育過程中GSH、GSSG、總谷胱甘肽（GSH+GSSG）含量和GSH/GSSG比值的變化

GSH是植物體內一個重要的抗氧化劑和氧化還原勢的調節劑，作為DHA的電子供體，其氧化還原態是通過AsA-GSH循環來與AsA聯系[8]。由圖3看出，菠菜葉片中GSH含量隨著其生長進程逐漸降低，在幼葉含量最高，在衰老葉含量最低；GSSG先升高后降低，在成熟葉中含量最高，成熟后隨著葉片的衰老GSSG含量顯著降低；總谷胱甘肽（GSH+GSSG）含量先升高后降低，在成熟葉中含量最高，在衰老葉中顯著降低。

反映谷胱甘肽氧化還原狀態的GSH/GSSG比值在幼葉中最高，隨著葉片的生長顯著降低，到衰老時又有所升高（圖4）。