大豆卵磷脂取代卵黃對豬精液低溫保存的影響

摘要：為了進一步優(yōu)化豬精液低溫保存稀釋液配方，用不同濃度（1.50%、3.00%、4.50%）的大豆卵磷脂取代稀釋液中的卵黃，進行豬精液低溫保存試驗。結(jié)果表明，以卵磷脂完全取代豬精液低溫保存稀釋液中的卵黃時，300%、1.50%濃度組與含20.00%卵黃的常用稀釋液保存效果相當（3%：P>0.05，1.5%：P<0.01），其中含150%卵磷脂的稀釋液保存效果最好。

關鍵詞：豬；精液；低溫保存；大豆卵磷脂

中圖分類號：S828.3+4文獻標識碼：A文章編號：1003-4374（2013）01-0036-03

卵磷脂（Phosphatidyl choline， PC） 在醫(yī)學上具有延緩衰老、保護肝臟、健腦益智和預防心血管疾病等多方面的作用。近年來，無動物性成分精液稀釋液的研究已逐漸成熟，并取得了良好的效果。在國外，以PC取代卵黃或奶類配制牛精液冷凍稀釋液已經(jīng)實現(xiàn)商業(yè)化，且正在逐步取代傳統(tǒng)的冷凍稀釋液。在國內(nèi)，這項研究也取得了一定的進展[1，2]。但是，目前豬精液低溫保存技術尚未實現(xiàn)商業(yè)化，也沒有PC在豬精液低溫保存方面應用的研究報道。

1材料與方法

1.1主要儀器設備及試劑

電子冷暖箱（北京福意聯(lián)電器有限公司），相差顯微鏡（OLYMPUSCH3_DO 6M01434， Japan），大豆PC（武漢華怡達化工有限公司）。

1.2試驗動物

廣西科達畜禽改良有限責任公司種豬場健康、正常采精的種公豬。

1.3試驗方法

1.3.1采精 采用手握法采集公豬精液，每次采得的豬精液用四層脫脂紗布過濾，去除膠狀物，同時檢查原精品質(zhì)，精子活力0.75以上，氣味、色澤正常者供稀釋保存用。

1.3.3精液品質(zhì)檢查 在檢測精子活力（直線運動的精子占視野中精子的百分率）的同時，記錄精子有效存活時間（精子活力為0.4的保存時間）和總存活時間（精子全部死亡的保存時間），并計算存活指數(shù)∑[（上次活力+下次活力）/2×時間間隔]。

1.4試驗設計及數(shù)據(jù)處理

試驗共分4個組，對照組的稀釋液為葡萄糖-蔗糖-卵黃液（表1-1），試驗組1-3的稀釋液在對照組的基礎上，用不同濃度（1.50%、3.00%、4.50%）的大豆卵磷脂取代對照組中的20.00%的卵黃。試驗重復6次。

試驗所得的各組數(shù)據(jù)均以Mean±SD表示，采用SPSS 17.0軟件進行方差分析檢驗各組之間差異的顯著性。

2結(jié)果

從表2-1可以看出，各試驗組精子稀釋后活力與對照組相比差異不顯著（P>0.05），1.5%、3%濃度組一定程度上還延長了精子的有效保存時間，但差異不顯著（P>0.05），而4.5%濃度組有效存活時間不如對照組（P<0.05）。從精子總存活時間看，3個試驗組均比對照組高，其中1.5%、3%濃度組與對照組相比差異極顯著（P<0.01），4.50%組與對照組差異不顯著（P<0.05）。3個試驗組的存活指數(shù)均低于對照組，且4.50%濃度組與對照組差異極顯著（P<0.01），說明了含PC稀釋液中精子活力下降較含卵黃的稀釋液快。結(jié)果表明，用低濃度大豆PC取代卵黃在低溫下保存豬精液，雖然精子活力相對下降較快，但可以有效地延長精子的存活時間。

3討論

迄今為止，豬精液0-5 ℃下液態(tài)保存在國內(nèi)外未見商業(yè)化成功的報道，究其原因是：豬精子在保存過程中，容易受到各種刺激而產(chǎn)生不利于精子生存的影響。其中，溫度變化所造成的刺激對精子的打擊極大，當溫度急劇下降至10℃以下時，精子會發(fā)生冷休克現(xiàn)象，并且這個過程是不可逆轉(zhuǎn)的，對精子來說是致命的傷害；同時，低溫打擊使精液產(chǎn)生大量的精子細胞活性氧（reactive oxygen special，ROS），而ROS能夠破壞精子的蛋白表達結(jié)果，從而造成細胞凋亡。因此，一方面，低溫保存精液時，要在稀釋液中加入低溫保護劑，防止精子發(fā)生冷休克而影響精子的生存和保存質(zhì)量；另一方面，研制更為簡易、高效的豬精液低溫保存稀釋液配方及操作程序，已經(jīng)成為豬精液保存技術的研究熱點。

目前常用的動物源性低溫保護劑是卵黃和牛奶，但其作用機理尚未闡明。1939年，Phihphs首次將卵黃作為添加劑應用于低溫保存稀釋液中[3]。研究發(fā)現(xiàn)，稀釋液中添加的卵黃和奶類主要是利用其磷脂成分尤其是PC而起到保護作用。PC由法國人Gobley于1844年首先從蛋黃中分離出來，其化學名稱為磷脂酰膽堿，由磷脂酸和膽素合成，純凈品在常溫下為一種無色無味的白色固體，但常由于制取或精制方法、儲存條件不同而呈現(xiàn)淡黃色至棕色。PC的融點較低，低溫下不易凍結(jié)，從而保護精子的生存，此外，脂蛋白以及含磷脂的脂蛋白復合物也有防止精子冷休克的作用[3]。PC能夠參與細胞膜的組成，改善脂類的代謝[4]，是神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿（acetylcholine， Ach）的主要來源。PC具有抗氧化功能，攝取PC可以修補因氧化應激因素造成損傷的細胞膜，增加細胞膜脂肪酸的不飽和度[5]，使細胞膜軟化，改善細胞膜的功能，對細胞膜的選擇通透性產(chǎn)生影響[6]；還能夠修復線粒體[7]，促進脂蛋白的合成、再生，維持細胞內(nèi)酶的活性，改善細胞代謝功能，延緩細胞衰老。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，卵黃PC還具有乳化作用、離型作用、溶解作用、潤濕作用、與蛋白質(zhì)的結(jié)合作用和防止淀粉老化作用等理化功能。因此，目前卵黃或卵黃提取物被廣泛應用于牛、豬、羊等動物精液的冷凍保存稀釋液來提高冷凍效果。雖然卵黃中的PC含量較高，但同時它也存在一些缺陷。從成本控制的角度來看，卵黃PC的提純工藝和分離難度較高，造成其使用成本較大；從疫病防治的角度來看，由于卵黃為動物性成分，不可避免會受到微生物的污染，這些微生物會隨著精液保存稀釋液的轉(zhuǎn)移而在地區(qū)間傳播，這必將影響到動物冷凍精液在國內(nèi)外的種質(zhì)交流，同時也可能造成疫病傳播，增加了疫病防控的難度。因此，許多學者開始主張使用無動物成分稀釋液來保存牛、羊的精液，如用植物性PC（如大豆PC）取代卵黃保存精液，以彌補卵黃的缺陷，避免病原體的傳播[8]。

天然PC廣泛存在于動、植物體內(nèi)，以蛋黃、大豆內(nèi)含量較多[9]，其它如動物腦組織、肝臟、骨髓、植物種子（菜籽、棉籽、向日葵、花生、玉米、紅花籽等）也可用于提取PC。其中卵黃PC和大豆PC，因其來源不同而成分、功能各異。有數(shù)據(jù)表明，雞蛋黃中含有占蛋黃總重10%以上的磷脂質(zhì)，大豆PC占大豆總重的0.40%-0.45%，卵黃PC中磷脂酰膽堿的含量比大豆PC高3倍，而大豆PC的不飽和脂肪酸含量較高，且不飽和脂肪酸有多種重要的生理活性，但其氧化穩(wěn)定性比卵黃PC差[10]。另外，大豆PC乳化性和分散性良好[8，11]，能溶于水成為膠體狀態(tài)[3]，具有應用效果相對確定、配制方便、易于標準化、不易污染（大豆PC本身具有抗菌及殺菌功能）、成本較低等諸多優(yōu)點[7]。

由于大豆PC具有上述優(yōu)點，不少學者將其應用于家畜的精液保存（尤其是冷凍保存）中，取代稀釋液中的卵黃。丁瑜通過試驗，利用篩選出的含有大豆磷脂的冷凍稀釋液（Tris+7.3%大豆磷脂+6%甘油）和篩選出的含有卵黃的冷凍稀釋液（Tris+15%卵黃+6%甘油）做羊的配種試驗，取得了較好的受胎率，受胎率分別為59.5%和52.7%，說明大豆磷脂可以替代卵黃應用于生產(chǎn)[1]。同時，試驗還證明，溶解大豆磷脂時的溫度不同，其對羊精子的保護效果也不同，過高或過低的溫度都使大豆磷脂對精子產(chǎn)生不同程度的影響。當溶解溫度為60℃時，冷凍-解凍后的精子活率和頂體完整率較高（P<0.05），保存效果最好。胡傳活在PC取代卵黃冷凍牛精液的試驗中認為，各種濃度的PC對不同公牛的精子形態(tài)都起到了與卵黃相當?shù)谋Ｗo作用，低濃度的PC可以使精子活力和復蘇率有明顯提高，而隨著濃度的升高，精子活力和復蘇率逐漸下降[2]。總之，除了含6.00% PC試驗組外其余三個試驗組（分別含4.50%、3.00%和1.50% PC）都可獲得與含20.00%卵黃的常用稀釋液相當或更好的精液質(zhì)量，其中含1.50% PC的稀釋液效果最好。本試驗中在低溫保存條件下各種濃度的大豆PC均使豬精子的總存活時間延長，而低、中濃度的大豆PC有效地延長了豬精子的有效保存時間，說明低、中濃度的大豆PC對精子起到了與卵黃一樣的保護作用。而含大豆PC稀釋液中精子活力下降較含卵黃的稀釋液快，可能是由于大豆PC中不飽和脂肪酸含量較高、氧化穩(wěn)定性比卵黃PC差，從而造成對抗低溫打擊方面不如卵黃好的緣故。另外，高濃度組對豬精子低溫保存效果沒有起到明顯的改善作用，可能與該組稀釋液黏度過大，影響了精子的運動存在一定關系，也可能與試驗檢測指標偏少，不足以體現(xiàn)PC的作用效果有關。

總之，適當濃度的大豆PC可以取代稀釋液中的卵黃，應用于豬精液的低溫保存。至于不同條件下大豆PC在豬精液低溫保存中的效果與作用機制，還有待進一步深入研究。

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