砧木（葫蘆）種子干熱滅菌消毒處理研究

摘 要： 以砧木（葫蘆）種子為試驗材料，對其進行干熱處理，處理前后檢測種子細菌性果腐病及黃瓜綠斑駁花葉病毒的帶菌、帶毒情況，同時檢測干熱處理對種子發芽勢及發芽率的影響。結果表明：干熱處理可以顯著降低種子帶菌、帶毒量；同時干熱處理對種子發芽率、發芽勢的影響在種子水分恢復到4% 時即可恢復至96%。

關鍵詞： 葫蘆； 干熱處理； 細菌性果腐病； 黃瓜綠斑駁花葉病毒； 發芽率； 發芽勢

近年來，西瓜種植的產業化、規模化趨勢愈加明顯，隨著生產規模的擴大，嫁接栽培逐漸成為廣大農戶的首選，但嫁接過程中出現的西瓜嫁接死苗、果實壞瓤等現象，逐漸成為困擾廣大種植戶的突出問題。研究表明，西瓜嫁接死苗、果實壞瓤等現象的產生與作為砧木的種子本身帶有細菌性果腐病菌、黃瓜綠斑駁花葉病毒有密切關系。現有的種子消毒方法主要是熱燙浸種、單一藥劑處理等，在實際應用過程中容易出現消毒不徹底、影響砧木種子芽率等問題。2011—2012年，合肥豐樂種業股份有限公司、安徽省西瓜甜瓜工程技術研究中心對現在最新的種子處理手段——干熱處理的滅菌消毒效果及其對種子發芽率、發芽勢的影響進行了研究，干熱處理可有效避免常規處理的不足之處，不僅可以殺死種子表面附著的病菌，還可以殺死潛伏在種子內部的病菌[1]，并鈍化病毒，起到其他種子消毒方法所達不到的效果。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試種子：選取檢測帶有細菌性果腐病及黃瓜綠斑駁花葉病毒的砧木（葫蘆）種子。

1.2 研究方法

1.2.1 供試種子處理 將西瓜細菌性果腐病標準菌株稀釋成≥106 cfu·mL-1的菌懸液，用菌懸液浸泡供試種子1 h，然后放入鼓風干燥箱28 ℃ 烘干。

1.2.1 葫蘆種子干熱處理 供試種子按照每批次1 000粒的標準，分成3個批次，分別編號為H-1、H-2、H-3。供試種子先通過低溫烘干將水分降低至2% 以下，72 ℃ 處理12 h。處理結束后將種子進行室內常規貯存，等種子水分恢復至4% 的時候再次檢測發芽率、發芽勢。每個批次處理種子 1次重復。

1.2.2 西瓜細菌性果腐病檢測 供試種子在干熱處理前后分別選取1% 的種子，使用蒸餾水浸泡24 h后，直接使用種子浸出液進行PCR檢測和電泳分析[2]。以標準菌株做陽性對照，以非果腐病病原細菌的核酸作陰性對照，用雙蒸水代替模板DNA作為空白對照，進行PCR擴增，將擴增產物進行瓊脂糖電泳分析。

將種子浸出液在BFB-08，TWZ半選擇性培養基所制備的平皿培養基上劃線，每處理做3個皿，28 ℃ 恒溫培養48 h，觀察結果。

1.2.3 黃瓜綠斑駁花葉病毒檢測 選取3 000粒供試種子（重點挑選畸形、不成熟的種子）分成每重復500粒的6次重復，其中3次重復直接播于滅菌土中，另外3次重復經過干熱處理后再播于滅菌土中。待長出3～4片葉后，每株采集1片葉片（表現癥狀的植株采集染病葉片），按照試驗重復將采集的葉片混合后提取總RNA，反轉錄合成cDNA后，進行PCR擴增[3]。以標準病毒做陽性對照，非標準植物病毒做陰性對照，用雙蒸水代替模板DNA作空白對照，進行PCR擴增，將擴增產物進行瓊脂糖電泳分析。

2 結果與分析

2.1 干熱處理前后種子帶菌、帶毒檢測結果

種子細菌性果腐病及黃瓜綠斑駁花葉病毒的檢測分別參考《SN/T 1465-2004 西瓜細菌性果斑病菌檢疫鑒定方法》[2]中的常規PCR、半選擇培養基檢測方法和《SN/T 2344-2009 黃瓜綠斑駁花葉病毒檢疫鑒定方法》[3]中的RT-PCR檢測方法。試驗結果表明：通過干熱處理后，原先可以檢測到帶有細菌性果腐病及黃瓜綠斑駁花葉病毒的種子（H-1、H-2、H-3同批種子）均未再次檢測到帶菌、帶毒，干熱處理可以有效殺滅種子病菌、病毒。

圖1是試樣種子的細菌性果腐病常規PCR電泳圖。由圖中可以看到，原先帶有細菌性果腐病病原的試樣H-1、H-2、H-3經過干熱處理已不帶相關病原。同時觀察半選擇培養基也可以發現原先可以觀察到大量菌落的試樣干熱處理后無法觀察到相關菌落，僅有部分雜菌菌落存在，同時雜菌菌落數量也大幅下降。

圖2是試樣的RT-PCR擴增產物電泳圖。圖中可以明顯觀察到處理后無法檢測到黃瓜綠斑駁花葉病毒擴增產物的存在，鑒于RT-PCR本身引物的特異性，在排除操作過程中植物組織總RNA提取失敗的情況下可以判定試樣種子處理后原帶有的黃瓜綠斑駁花葉病毒已被鈍化，在植株中不再發病。

2.2 干熱處理對種子發芽勢、發芽率的影響

從表1可以看出，通過干熱處理，種子發芽率呈現明顯下降的趨勢，處理后隨著種子水分的緩慢恢復，種子發芽勢、發芽率也明顯恢復，特別是當種子水分恢復至4%時，發芽勢及發芽率就已恢復至處理前水平（大約96%）。

3 討 論

通過合理的干熱處理流程可以有效殺滅種子本身帶有的細菌性果腐病病原，同時鈍化黃瓜綠斑駁花葉病毒使其不再發病。細菌性果腐病和黃瓜綠斑駁花葉病毒病是現在嚴重危害西瓜生產的2種檢疫性病害，其本身可由種子攜帶傳播，并在嫁接操作中造成大面積擴散，從而對西瓜商品化生產造成巨大危害。干熱處理在有效殺滅或鈍化病原的同時又不會顯著降低種子的發芽能力，因此可以說是種子后期處理的一種有效途徑，豐樂種業已在部分產品上開始應用干熱處理滅菌消毒技術。

在試驗過程中，筆者發現種子處理效果的保持易受使用環境的影響。細菌性病原主要通過接觸傳染，嫁接操作過程中，由于工具、環境等因素的影響導致嫁接苗帶菌一直是長期困擾廣大西瓜種植戶的問題，如何通過整體過程控制最終達到“無菌種子——無菌嫁接苗——無菌種苗”是一項系統性的工作，對其還需要進一步研究，以尋找后續過程的全面有效的解決方案。

參考文獻

[1] 李明，李佐，杜翠花. 干熱處理對甜椒種攜帶真菌、細菌防效研究[J]. 山西農業大學學報，2000，20（1）： 119-121.

[2] 中華人民共和國質量監督檢驗檢疫總局. SN/T 1465-2004 西瓜細菌性果斑病菌檢疫鑒定方法[S]. 北京：中國標準出版社，2005.

[3] 中華人民共和國質量監督檢驗檢疫總局. SN/T 2344-2009 黃瓜綠斑駁花葉病毒檢疫鑒定方法[S]. 北京：中國標準出版社，2009.