紅曲中桔霉素的Ames試驗

摘要：采用鼠傷寒沙門氏菌試驗（Ａｍｅｓ試驗），通過觀察0.2、1.0、5.0、25.0 μg/皿桔霉素處理對鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株ＴＡ９７、ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１０２回復(fù)突變的影響，檢測紅曲中桔霉素的致突變性。結(jié)果表明，桔霉素受試物組回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的２倍，亦未呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系，試驗結(jié)果為陰性，紅曲中桔霉素未表現(xiàn)出致突變性。

關(guān)鍵詞：桔霉素；鼠傷寒沙門氏菌試驗（Ａｍｅｓ試驗）；致突變性

中圖分類號：Ｑ３１９＋．３３文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）08－1658-02

紅曲由紅曲霉菌發(fā)酵而成，被廣泛應(yīng)用于制作食醋、腐乳、食品色素以及中藥等方面。紅曲在我國已有１ ０００多年的應(yīng)用歷史，尤其是在降血脂物質(zhì)Ｍｏｎａｃｏｌｉｎ K被發(fā)現(xiàn)后，其更是在醫(yī)藥領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注［１］。然而在１９９５年，法國Ｂｌａｎｃ博士證實了紅曲霉具有產(chǎn)生真菌毒素桔霉素的能力，從而使紅曲產(chǎn)品的安全性受到了質(zhì)疑［２］。

桔霉素是紅曲霉菌的次級代謝產(chǎn)物，屬于中等偏劇毒性毒素［３］，具有腎毒性，能引起試驗動物的腎臟腫大、尿量增多、腎小管擴張和上皮細胞變性壞死等癥狀［４］，并且由于桔霉素具有潛在的致畸性，會對人體產(chǎn)生潛在危害［５］，而在國外，桔霉素更是被列為食品污染的嚴格控制指標［６］。小鼠的急性毒性試驗表明其ＬＤ５０為１１２ ｍｇ／ｋｇ［７］，在此基礎(chǔ)上，采用鼠傷寒沙門氏菌試驗（Ａｍｅｓ試驗）研究桔霉素的致突變性，為深入研究其遺傳毒性提供科學(xué)依據(jù)。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１原料與試劑桔霉素、葡萄糖－６－磷酸鈉鹽、氧化型輔酶Ⅱ、敵克松、疊氮鈉、２－氨基芴、１，８－二羥基蒽醌、二甲基亞砜均由Ｓｉｇｍａ公司提供，Ｄ－生物素、Ｌ－組氨酸等其他試劑由武漢市伊格生物科技經(jīng)營部提供，多氯聯(lián)苯（ＰＣＢ）誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿（肝Ｓ９液）以及ＴＡ９７、ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１０２由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院提供。桔霉素用二甲基亞砜配制成2.0、10.0、50.0、250.0 μｇ／ｍＬ桔霉素溶液供試驗用。

１．１．２培養(yǎng)基及１０％ Ｓ９混合液①底層培養(yǎng)基：由每４００ ｍＬ １．５％瓊脂培養(yǎng)基中加入８ ｍＬ磷酸鹽貯備液和２０ ｍＬ ０．４ ｇ／ｍＬ葡萄糖溶液在８０ ℃左右混勻制成。②頂層培養(yǎng)基：由每１００ ｍＬ頂層瓊脂［ｍ（瓊脂粉）∶ｍ（ＮａＣｌ）＝６∶５］中加入１０ ｍＬ ０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ的組氨酸－生物素溶液混勻配制而成。③１０％ Ｓ９混合液：每１０ ｍＬ １０％ Ｓ９混合液由６．０ ｍＬ ０．２ ｍｏｌ／Ｌ （ｐＨ ７．４）磷酸鹽緩沖液、０．２ ｍＬ １．６５ ｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ溶液、０．２ ｍＬ ０．４ ｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２溶液、１．０ ｍＬ ０．０５ ｍｏｌ／Ｌ 葡萄糖－６－磷酸鈉鹽溶液、１．６ ｍＬ ０．０２５ ｍｏｌ／Ｌ氧化型輔酶－Ⅱ溶液以及１．０ ｍＬ的肝Ｓ９液混勻配制而成。

１．２方法

按照ＧＢ １５１９３．４—２００３，試驗菌株選用經(jīng)過鑒定合格的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株ＴＡ９７、ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１０２，體外活化系統(tǒng)為ＰＣＢ誘導(dǎo)的肝S9液制備的10% Ｓ９混合液。

將桔霉素受試物組桔霉素劑量設(shè)置為０．２、１．０、５．０、２５．０ μｇ／皿。各受試物組平板的配制采用平板摻入法，各在４５ ℃保溫的頂層培養(yǎng)基中加入新鮮增菌液０．１ ｍＬ，2.0、10.0、50.0、250.0 μｇ／ｍＬ桔霉素溶液０．１ ｍＬ，在需要活化時另加入１０％ Ｓ９混合液０．５ ｍＬ，混勻，迅速倒入底層培養(yǎng)基中，平放固化，每組設(shè)置３個平行，在３７ ℃下培養(yǎng)４８ ｈ。同時設(shè)立空白對照組、陰性對照組和陽性對照組，在不加10% Ｓ９混合液時，菌株ＴＡ９７、ＴＡ９８、ＴＡ１０２選用的陽性物（陽性對照組中加入的對照指標）為敵克松，ＴＡ１００選用的陽性物為疊氮鈉；在加10% Ｓ９混合液時，菌株ＴＡ９７、ＴＡ９８、ＴＡ１００選用的陽性物為２－氨基芴，ＴＡ１０２選用的陽性物為１，８－二羥基蒽醌。

若桔霉素受試物組的回變菌落數(shù)超過自發(fā)回變菌落數(shù)（空白對照組）的２倍以上并具有劑量反應(yīng)關(guān)系，則可判定試驗結(jié)果為陽性，在相同條件下重復(fù)試驗２次；否則則可判定試驗結(jié)果為陰性，在相同條件下重復(fù)試驗１次。

２結(jié)果與分析

加入10% Ｓ９混合液的試驗組就相當于動物體的消化系統(tǒng)，它可以將加入的受試物代謝，這樣就可以檢測所加的受試物在代謝過程中有沒有產(chǎn)生致突變的物質(zhì)，而不加10% Ｓ９混合液時就是檢測受試物本身是否具有致突變性。試驗結(jié)果顯示，陽性對照組各菌株的回變菌落數(shù)均超過空白對照組的自發(fā)回變菌落數(shù)的２倍以上，表明各鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株對受試物桔霉素的檢測有效；而在加與不加體外活化系統(tǒng)（１０％ Ｓ９混合液）的條件下，各劑量桔霉素受試物組的回變菌落數(shù)均與空白對照組的自發(fā)回變菌落數(shù)相近，并未超過其２倍，亦無劑量反應(yīng)關(guān)系，表明桔霉素在試驗劑量范圍內(nèi)，在加與不加１０％ Ｓ９混合液兩種情況下，桔霉素的Ａｍｅｓ試驗結(jié)果為陰性，表示桔霉素未表現(xiàn)出致突變性。各菌株的回變菌落數(shù)見表１。

３小結(jié)與討論

根據(jù)相關(guān)報道，桔霉素可以致畸、導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，可以誘發(fā)突變，但在試驗條件下，受試物組桔霉素濃度為250.0 μｇ／mL，即劑量最高達到２５.０ μｇ／皿時，其Ａｍｅｓ試驗的結(jié)果表明其未表現(xiàn)出致突變性。而這一試驗結(jié)果與Ｍａｒｔｉｎ等［8］的在桔霉素濃度達到１００ μｇ／ｍＬ時可引起ＤＮＡ的單鏈損傷的研究結(jié)果不一致，但與Ｓａｂａｔｅｒ－Ｖｉｌａｒ等［９］所研究的桔霉素在低劑量時未表現(xiàn)出致突變性的結(jié)果相一致。在中國制定的相關(guān)標準ＱＢ／Ｔ ２８４７—２００７中規(guī)定，功能性紅曲米（粉）中的桔霉素含量（以絕干計）≤５０ μｇ／ｋｇ，在國家標準ＧＢ/Ｔ ５００９．２２２—２００８中規(guī)定，對液態(tài)樣品中桔霉素的定量限為５０ μｇ／Ｌ，固態(tài)樣品為１ ｍｇ／ｋｇ。在紅曲的實際應(yīng)用中必須嚴格控制桔霉素的含量，避免毒副作用和不良反應(yīng)的發(fā)生，保證紅曲藥用和食用的安全性。

參考文獻：

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