一株產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì)

摘要：以羧甲基纖維素鈉為惟一碳源，從土壤中篩選出一株產(chǎn)纖維素酶的菌株ＸＷ－１３，其搖瓶培養(yǎng)液的ＣＭＣ酶活力為１５．０５ μｇ／ｍＬ，濾紙酶活力為１５．１３ μｇ／ｍＬ。酶學(xué)性質(zhì)試驗(yàn)表明，該酶的最適反應(yīng)ｐＨ ７．０，在ｐＨ ５．０～９．０時(shí)有較好的穩(wěn)定性，酶活力保持６０％以上。該酶的最適反應(yīng)溫度為４０ ℃，在溫度為２０ ℃時(shí)基本穩(wěn)定，保溫２ ｈ仍有８０％以上的活力。在化合物濃度為０．２ ｍｇ／ｍＬ的條件下，ＮＨ４＋、Ｎａ＋、Ｆｅ２＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋和Ｌｉ＋對(duì)酶活力有增進(jìn)作用，Ｈｇ＋和Ｃｕ２＋對(duì)酶活力有抑制作用。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)纖維素酶菌株；篩選；酶學(xué)性質(zhì)

中圖分類號(hào)：ＴＱ９２０．１文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）08－1566-03

纖維素是自然界中最豐富的可再生資源，是植物通過(guò)光合作用儲(chǔ)能的主要形式［１］。關(guān)于土壤中纖維素酶的研究為充分利用纖維素提供了一條廣闊的途徑［２］。目前關(guān)于纖維素酶的研究報(bào)道集中于真菌與細(xì)菌方面，真菌主要以木霉為主［３－６］。纖維素酶是一類可以水解β－１，４葡萄糖苷鍵，使纖維素分解成纖維二糖和葡萄糖的一個(gè)酶系的總稱［７］。該酶系是由葡聚糖內(nèi)切酶（Ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ，ＥＧ， ＥＣ３．２．１．４）、葡聚糖外切酶（Ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ，ＣＢＨ，ＥＣ３．２．１．９１）、β－葡萄糖苷酶（β－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，ＢＧ， ＥＣ３．２．１．２１）３個(gè)組分組成的誘導(dǎo)復(fù)合酶系［８］。

目前，纖維素酶的應(yīng)用日益廣泛，而纖維素酶高產(chǎn)菌卻相對(duì)較少，因此高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選是關(guān)鍵問(wèn)題之一［９］。從土壤中篩選到一株產(chǎn)纖維素酶的菌株，并對(duì)該菌株進(jìn)行了產(chǎn)酶條件和酶學(xué)性質(zhì)的研究，以期為纖維素酶產(chǎn)生菌的開(kāi)發(fā)利用打下基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１土壤樣品與化學(xué)試劑土壤樣品采自樹(shù)木種植地；化學(xué)試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)，均為分析純。

１．１．２培養(yǎng)基富集培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉４．０ ｇ，ＮＨ４Ｃｌ ５．０ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ １．０ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １．０ ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４ １．０ ｇ，去離子水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７．０～７．２。分離培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉４．０ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ４．０ ｇ，ＫＣｌ ５．０ ｇ，ＮａＮＯ３ ３．０ ｇ， Ｋ２ＨＰＯ４ １．０ ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ，瓊脂１８．０ ｇ，去離子水１ ０００ ｍＬ，自然ｐＨ。種子培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉 ８．０ ｇ，酵母粉 ５．０ ｇ，蛋白胨３．０ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ５．０ ｇ，ＫＣｌ ５．０ ｇ，ＮａＮＯ３ ３．０ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ １．０ ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ，去離子水１ ０００ ｍＬ，自然ｐＨ。發(fā)酵培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉 １５．０ ｇ，大豆蛋白胨 ８．０ ｇ，酵母粉 ４．０ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １．０ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．２５ ｇ，去離子水１ ０００ ｍＬ，自然ｐＨ。ＬＢ培養(yǎng)基：胰蛋白胨１０．０ ｇ，酵母膏 ５．０ ｇ，ＮａＣｌ ５．０ ｇ，去離子水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７．０。ＬＡ培養(yǎng)基：ＬＢ培養(yǎng)基中加入１．８％的瓊脂粉。

１．２方法

１．２．１纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選與粗酶液的制備 取１００ μＬ土壤樣品溶液置于富集培養(yǎng)基中，在３７ ℃培養(yǎng)２４ ｈ，將富集液用無(wú)菌水梯度稀釋，涂布于瓊脂分離培養(yǎng)基上，倒置于３７ ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)２４ ｈ，然后用剛果紅染色法［８］染色５ ｍｉｎ，去離子水沖洗后放置５ ｍｉｎ，觀察菌落周圍有無(wú)透明圈，若有透明圈則初步證明該菌株具有產(chǎn)纖維素酶的能力，挑取透明圈較大的單菌落進(jìn)行劃線，進(jìn)一步分離純化。將初篩得到的菌株接入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)１２ ｈ，以２％的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)２４ ｈ，然后4 ℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，收集發(fā)酵上清液為粗酶液。用ＤＮＳ法測(cè)定酶活力。

１．２．２纖維素酶活力的測(cè)定纖維素酶（ＣＭＣ酶，濾紙酶）活力測(cè)定均參照２００３年９月１３日發(fā)布的中華人民共和國(guó)輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《纖維素酶制劑》進(jìn)行［１０］。酶活力定義：在上述試驗(yàn)條件下，1 mＬ酶液水解底物產(chǎn)生相當(dāng)1 μg葡萄糖的還原糖量為1個(gè)酶活力單位，以μg/mL表示。

１．２．３酶學(xué)性質(zhì)的研究

１）最適反應(yīng)ｐＨ。配制不同ｐＨ的濃度為０．０５ ｍｏｌ／Ｌ的緩沖液，緩沖體系及其ｐＨ分別為：ＫＣｌ－ＨＣｌ緩沖液（ｐＨ ２．０）；甘氨酸－ＨＣｌ緩沖液（ｐＨ ３．０）；檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液（ｐＨ ４．０～５．０）；磷酸緩沖液（ｐＨ 6.8～8．０）； 甘氨酸-ＮａＯＨ緩沖液（ｐＨ 9.0～10．０）；Ｎａ２ＨＰＯ４－ＮａＯＨ緩沖液（ｐＨ ９．０～１２．０）。在ｐＨ ２．０～１２．０條件下進(jìn)行酶活力測(cè)定。以酶活力最大值為１００％，在其他條件下測(cè)得的酶活力相對(duì)于最大酶活力的比例即為該酶的相對(duì)酶活力［１３］。

２）ｐＨ穩(wěn)定性。將酶液與不同ｐＨ的緩沖液混合，４０ ℃保溫３ ｈ后測(cè)定剩余酶活力。

３）最適溫度。不同溫度條件（２５～６０ ℃）下，在ｐＨ為７．０的０．０５ ｍｏｌ／Ｌ的磷酸緩沖液中反應(yīng)３０ ｍｉｎ，測(cè)定相對(duì)酶活力。

４）溫度穩(wěn)定性。不同溫度條件（２０～８０ ℃）下，在ｐＨ為７．０的０．０５ ｍｏｌ／Ｌ的磷酸緩沖液中保溫不同時(shí)間后立即冷卻，隨后進(jìn)行纖維素酶活力測(cè)定。

５）NH4+及金屬離子對(duì)纖維素酶活力的影響。將NH4+及金屬離子與酶液于２０ ℃條件下保溫２ ｈ后測(cè)定樣品剩余的酶活力，以不添加任何離子的對(duì)照酶活力為１００％，在NH4+及金屬離子存在條件下的酶活力相對(duì)于對(duì)照酶活力的比例即為添加NH4+及金屬離子后的相對(duì)酶活力。

２結(jié)果與分析

２．１酶活力測(cè)定回歸方程的建立

分別取10 ｍｇ／ｍＬ的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液０．０、０．25、0.50、0.75、１．０0、１．25、1．5０、1．75 ｍＬ置于２５ ｍＬ具塞試管中，用去離子水補(bǔ)足至２．０ ｍＬ，加入２．０ ｍＬ ＤＮＳ試劑。置于沸水中煮沸５ ｍｉｎ顯色，然后迅速冷卻，用去離子水定容至２５ ｍＬ，以空白液為對(duì)照，置于５４０ ｎｍ處測(cè)定吸光度。結(jié)果（圖１）表明，當(dāng)葡萄糖濃度為０~０．７ mｇ／mＬ時(shí)，吸光度（ｙ）與葡萄糖濃度（ｘ）之間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為■＝１．６20 ２ｘ－０．０１４ 0，相關(guān)系數(shù)ｒ＝０．９９９ 4。

２．２纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選

通過(guò)ＣＭＣ－Ｎａ為底物的平板篩選法，從土壤中篩選出多株降解纖維素的菌株，其中ＸＷ－１３菌株在平板上經(jīng)剛果紅處理后透明圈直徑與菌落直徑比值為８．７５，將分離純化的菌株搖瓶發(fā)酵２４ ｈ后培養(yǎng)液中ＣＭＣ酶活力為１５．０５ μｇ／ｍＬ，濾紙酶活力為１５．１３ μｇ／ｍＬ。

２．３纖維素酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

２．３．１ｐＨ對(duì)相對(duì)酶活力的影響在不同ｐＨ條件下測(cè)得的酶活力相對(duì)于最大酶活力的比例即為該酶的相對(duì)酶活力。結(jié)果（圖２）表明，ＣＭＣ酶最適酶促反應(yīng)ｐＨ ７．０；ｐＨ ４．０~６．０，相對(duì)酶活力隨著ｐＨ的升高而迅速增加，在ｐＨ ４．０時(shí)相對(duì)酶活力僅有１５．４％左右；ｐＨ ７．０~９．０，相對(duì)酶活力隨著ｐＨ的升高而迅速下降，在ｐＨ ９．０時(shí)相對(duì)酶活力只有２３．０％左右。濾紙酶最適反應(yīng)ｐＨ ７．０；ｐＨ ３．０~６．０，相對(duì)酶活力隨著ｐＨ的升高而迅速增加，在ｐＨ為３．０時(shí)相對(duì)酶活力僅有４．７％左右；ｐＨ ８．０~１０．０，相對(duì)酶活力隨著ｐＨ的升高而迅速下降，在ｐＨ １０．０時(shí)相對(duì)酶活力為２．３％。

２．３．２ｐＨ對(duì)酶穩(wěn)定性的影響將酶液與不同ｐＨ的緩沖液充分混合，４０ ℃保溫３ ｈ后測(cè)定剩余酶活力。結(jié)果（圖３）表明， ＣＭＣ酶相對(duì)酶活力在ｐＨ ５．０～９．０時(shí)具有較好的穩(wěn)定性，相對(duì)酶活力為７０％以上，ｐＨ低于５．０或高于９．０時(shí)相對(duì)酶活力驟降，ｐＨ ３．０時(shí)相對(duì)酶活力降為１２．５％，ｐＨ １１．０時(shí)相對(duì)酶活力降為１４．２％。濾紙酶相對(duì)酶活力在ｐＨ ５．０～９．０時(shí)具有較好的穩(wěn)定性，相對(duì)酶活力為６０％以上，ｐＨ低于５．０或高于９．０時(shí)相對(duì)酶活力驟降，ｐＨ ３．０時(shí)相對(duì)酶活力降為２２．７％，ｐＨ １１．０時(shí)相對(duì)酶活力降為１７．３％。

２．３．３溫度對(duì)相對(duì)酶活力的影響在不同溫度條件（２５～６０ ℃）下，ｐＨ為７．０時(shí)０．０５ ｍｏｌ／Ｌ的磷酸緩沖液中，反應(yīng)３０ ｍｉｎ測(cè)定相對(duì)酶活力。結(jié)果（圖４）表明，在４０ ℃時(shí)ＣＭＣ酶與濾紙酶具有最高酶活力。２５ ℃時(shí)ＣＭＣ相對(duì)酶活力為１９．２％，濾紙酶相對(duì)酶活力為１０．７％。溫度從２５ ℃到４０ ℃，酶活力隨溫度升高而升高；溫度從４０ ℃到６０ ℃，酶活力隨溫度升高而降低，溫度為６０ ℃時(shí)，ＣＭＣ酶相對(duì)酶活力為１６．９％，濾紙酶相對(duì)酶活力為６．７％。

２．３．４溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響以常溫放置的酶液相對(duì)酶活力為１００％。將酶液于不同溫度下保溫不同時(shí)間后立即冰水浴冷卻，測(cè)定酶活力。圖５表明，在２０ ℃的條件下ＣＭＣ酶具有最好的穩(wěn)定性，１８０ ｍｉｎ后還具有８０％左右的酶活力。當(dāng)溫度到達(dá)５０ ℃以上時(shí)，３０ ｍｉｎ內(nèi)ＣＭＣ酶活力下降迅速，３０ ｍｉｎ后相對(duì)酶活力不到４０％。從圖６可以看出，在２０和３０ ℃時(shí)濾紙酶具有較好的穩(wěn)定性，１８０ ｍｉｎ后還具有７０％左右的酶活力。當(dāng)溫度到達(dá)５０ ℃以上時(shí)，６０ ｍｉｎ內(nèi)濾紙酶活力下降迅速，６０ ｍｉｎ后相對(duì)酶活力不到３０％。

２．３．５ＮＨ４+及金屬離子對(duì)酶穩(wěn)定性的影響以發(fā)酵培養(yǎng)基不添加任何金屬離子為對(duì)照，即酶活力１００％。隨后添加濃度為０．２ ｍｇ／ｍＬ的不同化合物，與酶液在２０ ℃條件下保溫２ ｈ后測(cè)定樣品剩余酶活力，計(jì)算相對(duì)酶活力，結(jié)果如圖７。從圖7可以看出，加入ＦｅＳＯ４濾紙酶活力略有下降，CMC酶活力略有上升，而加入ＬｉＳＯ４、ＭｎＳＯ４、ＺｎＳＯ４、ＭｇＣｌ２和ＣａＣＯ３ ＣＭＣ酶和濾紙酶活力均有所上升；加入（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＮａＣｌ和ＫＣｌ后酶活力有一定幅度上升，加入（ＮＨ４）２ＳＯ４后ＣＭＣ酶相對(duì)酶活力達(dá)到了１４５.0％，濾紙酶相對(duì)酶活力達(dá)到了1３４.0％；加入Ｈｇ＋與Ｃｕ２＋對(duì)兩種酶活力均有一定抑制作用。

３小結(jié)

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，纖維素酶的作用日益凸顯，其在飼料、糧食加工、蔬菜水果加工、副食品釀造以及紡織等各個(gè)方面都具有重要作用，其分解秸稈產(chǎn)生燃料乙醇也為新能源的開(kāi)發(fā)研究打下了理論基礎(chǔ)［１４］。因此近年來(lái)關(guān)于纖維素酶的研究層出不窮。從土壤中篩選了一株產(chǎn)一定活力纖維素酶的菌株ＸＷ－１３，其ＣＭＣ酶活力達(dá)到１５．０５ μｇ／ｍＬ，濾紙酶活力達(dá)到１５．１３ μｇ／ｍＬ，高于國(guó)內(nèi)一些文獻(xiàn)報(bào)道的酶活力［１３-１５］。ＸＷ－１３在ｐＨ ７．０，溫度為４０ ℃的情況下具有最高酶活力。在２０ ℃具有最好的酶穩(wěn)定性。加入Ｃｕ２＋與Ｈｇ２＋對(duì)酶活力有一定抑制作用，ＮＨ４+、Na+、K+對(duì)酶活力有一定促進(jìn)作用。

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