DADS誘導人胃癌BGC823細胞凋亡及其與smac和survivin表達的關系

[摘要] 目的 研究二烯丙基二硫（DADS）誘導胃癌BGC823細胞凋亡及其機制。 方法 實驗分DADS處理組和DADS未處理組，進行體外細胞培養(yǎng)，通過MTT法檢測DADS對胃癌BGC823細胞生長的影響、通過流式細胞術檢測細胞周期的分布、通過免疫組化檢測smac和survivin蛋白的表達。 結果 MTT實驗顯示DADS作用于BGC823細胞后，細胞生長抑制率呈時間、濃度依賴性增高，流式細胞術顯示DADS明顯將細胞周期阻滯于Ｇ２/Ｍ期，且呈濃度、時間依賴性。免疫細胞化學顯示處理組較未處理組smac表達明顯增加，而survivin蛋白表達明顯降低（P ＜ 0.05）。 結論 DADS可體外抑制人胃癌BGC823細胞增殖，使該細胞阻滯于G2／M期，其機制可能與上調smac及下調survivin的表達有關。

[關鍵詞] DADS； 胃癌； smac；survivin；細胞增殖； 細胞周期

[中圖分類號] R735.2[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-9701（2012）10-0001-03

Apoptosis and expression of survivin and smac in human gastric cancer BGC823 cells induced by Diallyl Disulfide

WANG Lixin1 SHI Shuisheng2 HE Runyuan1

1.Graduate School of Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China; 2.Gastroscopy Room， the Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China

[Abstract] Objective To investigate the apoptosis in human gastric cancer BGC823 cells induced by DADS， and study the mechanism. Methods The experiment was divided into two groups: treated group with DADS and untreated group. BGC823 cells proliferation was measured by MTT assay. Cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry (FCM). The expression of survivin， smac was detected by immunohistochemistry. Results MTT showed that DADS significantly inhibited BGC823 cells proliferation with a dose and time-dependent manner，F(xiàn)low cytometry revealed that DADS could markedly arrest cell cycle in G2/M phase with a dose and time-dependent manner. The expression of survivin and smac were observed in the two groups of immunohistochemistry，survivin was weakened markedly in the treated group， but smac was enhanced markedly in the treated group (P ＜ 0.05). Conclusion DADS had significant inhibitory effect on proliferation of human gastric cancer BGC823 cells in vitro and arrested cell cycle in G2/M，and its molecular mechanism is related to downregulating expression of survivin and upregulating expression of smac.

[Key words] Diallyl disulfide; Gastric cancer; Smac; Survivin; Cell proliferation; Cell cycle

胃癌是常見的惡性腫瘤，占我國消化道惡性腫瘤的第一位，并且在我國惡性腫瘤的發(fā)病率和病死率中均居首位[1]。胃癌早期診斷率低、生存期短、預后差。嚴重影響著人們的生活質量。腫瘤是機體在各種因素作用下，局部組織的細胞在基因水平上失去了對其生長的正常調控，導致細胞的異常增生而形成的新生物。二烯丙基二硫（diallyl disulfide，DADS）是大蒜主要有效成分烯丙基硫化物中的一類低分子量脂溶性化合物，可通過多種途徑起到抗腫瘤作用。近年來，DADS的抗癌作用受到國內外廣泛關注。其抗癌機制的研究已經(jīng)進入細胞和分子水平。本實驗以胃癌BGC823細胞為靶細胞，研究DADS誘導人胃癌BGC823細胞凋亡的機制及與survivin、smac的關系。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

DADS（diallyl disulfide）為Sigma公司產品，d420=1.0，Mr146．28，純度80％。人胃癌BGC823細胞購自武漢博士德生物工程試劑公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，新生胎牛血清購自杭州四季青公司，MTT為Sigma公司產品，碘化丙啶（PI）為Sigma公司產品，SP免疫組化試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司，DAB顯色盒購自武漢博士德生物工程有限公司，兔抗人survivin抗體、兔抗人smac抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司，儀器設備均由山西醫(yī)科大學實驗室提供。

1.2 細胞培養(yǎng)

BGC823細胞，用含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，并加入青霉素100 kU/mL，鏈霉素100 kU/mL的培養(yǎng)體系，在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 MTT實驗

取對數(shù)生長期細胞，常規(guī)胰酶消化制成單細胞懸液，調整細胞濃度，使細胞濃度為5 000個/孔，均勻接種于96孔平底培養(yǎng)板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后，加入處理因素，設一個調零孔，空白對照組，DADS處理組（包括40 mg/L，50 mg/L，60 mg/L三個濃度），每組設6個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h。然后每孔加入10 μL的5 g/L的MTT/PBS溶液，再培養(yǎng)4 h，后小心吸去全部的上清液，每孔加入100 μL的DMSO，置搖床上低速震蕩10 min，使結晶充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測OD490 nm的各孔吸光度值，并按下列公式計算抑制率。抑制率（IR%）=（1-處理組平均光密度值/對照組平均光密度值）×100%。

1.4 流式細胞術

取對數(shù)生長期細胞，常規(guī)胰酶消化制成單細胞懸液，調整細胞濃度，使細胞濃度為10 000個/孔，均勻接種于6孔平底培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，加入處理因素，設空白對照組，DADS處理組（包括40 mg/L，50 mg/L，60 mg/L三個濃度），每組設6個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)12及24 h。收集細胞，離心，1 000 rpm×5 min，棄上清，用4℃預冷的PBS溶液重懸細胞，離心，1000 rpm×5 min，重復1次，用4℃的70%乙醇固定4 h，檢測前用PBS洗3次，RNA酶消化，碘化丙啶（PI）染色，流式細胞儀分析DNA含量，檢測群體細胞中處于各個細胞周期中的細胞比例。

1.5 免疫細胞化學分析

取對數(shù)生長期細胞，常規(guī)胰酶消化成單細胞懸液，調整細胞濃度為1.5×106/mL，按上述分組制備細胞爬片，用4%多聚甲醛在4℃下固定20 min，PBS漂洗3次，每次2 min；滴加一滴內源性過氧化物酶封閉液（試劑1），室溫下孵育10 min，用蒸餾水洗3次，每次2 min；滴加封閉用正常羊血清（試劑2），室溫孵育10 min，甩干封閉液，滴加一抗，37℃過夜；PBS洗3次，每次2 min；滴加生物素標記羊抗兔二抗（試劑3），37℃孵育40 min；PBS洗3次，每次2 min；滴加HRP標記的鏈霉親和素（試劑4），37℃孵育10 min；PBS洗3次，每次2 min；滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯色5~10 min后，用自來水沖洗，蘇木精淺染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，圖像分析儀檢測平均光密度值及陽性率。

1.6 統(tǒng)計學分析

結果采用SPSS13.0軟件進行分析，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析，并采用SNKt檢驗進行多重比較，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DADS對胃癌BGC823細胞的抑制作用

MTT結果顯示，胃癌BGC823細胞在不同濃度、不同時間DADS作用后，OD490值均比對照組低，且隨著濃度增加、時間增加而明顯降低，其抑制率呈濃度時間依賴性增加（P ＜ 0.05），見表1。不同濃度之間進行多重比較，40 mg/L DADS的平均抑制率為12.8±0.038，50 mg/L DADS的平均抑制率為21.8±0.328，60 mg/L DADS的平均抑制率為31.1±0.328，各組之間進行多重比較，P ＜ 0.05；不同時間進行兩兩比較，DADS作用12 h后，平均抑制率為14.8±0.0883，作用24 h后，平均抑制率29.0±0.134，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）。

2.2 DADS對胃癌BGC823細胞周期分布的影響

流式細胞術顯示，40、50、60 mg/L 濃度的DADS作用于胃癌BGC823細胞12 h后，G2/M期百分率分別增加到9.2%、16.5%、37.3%，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）；24h后，G2/M期百分率進一步增加至14.3%、21.6%、52.4%，（P ＜ 0.05），各組之間進行兩兩比較，P均＜0.05，表明DADS將細胞阻滯在G2/M期，從而使細胞增殖受抑制，并與濃度及時間有依賴關系。

2.3 DADS對smac、survivin蛋白表達的影響

免疫組化顯示（表3、圖2），對照組、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L DADS作用于胃癌BGC823細胞24 h后，smac蛋白陽性率分別為35.1%、41.5%、55.7%、64.7%，光密度值分別為1.170±0.036、0.217±0.031、0.273±0.015、0.317±0.015，smac表達較對照組逐漸增強，P ＜ 0.05；survivin蛋白陽性率分別為67.2%、55.3%、48.3%、38.8%，光密度值分別為0.350±0.017、0.283±0.025、0.230±0.020、0.187±0.015，survivin表達較對照組逐漸減弱，P ＜ 0.05；LSDt法兩兩比較，P均＜0.05，表明各組之間差異有統(tǒng)計學意義。

3 討論

從天然植物中提取有效成分預防和治療癌癥并探討其發(fā)病機制已經(jīng)成為近年來的研究熱點。大蒜是百合科植物蒜的鱗莖，DADS（二烯丙基二硫）作為大蒜主要有效成分中的一類低分子量脂溶性化合物，目前國際上對其研究十分活躍，已有研究表明，DADS可抑制人類腫瘤細胞的增殖，例如結腸癌、肺癌、乳腺癌、肝癌等[2-6]。該研究主要探討DADS抑制人胃癌BGC823細胞的機制及與survivin、smac的關系。

survivin是凋亡抑制蛋白（inhibitor apoptosis proteins，IAP）家族的新成員，是迄今為止克隆出的最小IAP，survivin是由142個氨基酸組成的相對分子量為16.3×103的蛋白質，其編碼基因長度為14.5kb，位于17號染色體的q25，含有4個外顯子和3個內含子。survivin在胚胎、胎兒組織中規(guī)律表達，在成熟的組織中表達沉默， 而在絕大多數(shù)腫瘤組織及轉化的腫瘤細胞系中過量表達，survivin的這種高選擇性分布特點與其參與細胞增殖分化有關[7-9]。survivin能特異性地與末端效應細胞半胱氨酸蛋白酶caspase-3和caspase-7結合，通過在細胞內與微管的聚合和解聚，抑制其過表達引起的細胞凋亡，使一些轉化細胞逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視而無法清除，從而異常存活、累積，形成優(yōu)勢克隆參與腫瘤的發(fā)生；另外，survivin蛋白由于其獨特的亞細胞分布，被認為是處于細胞增殖與細胞死亡界面的分子，它可抑制凋亡蛋白酶，使腫瘤細胞逃避細胞周期G2/M期檢測點（checkpoint）的監(jiān)控，抵抗因DNA損傷或突變自身誘導的細胞凋亡，引起細胞生長及凋亡途徑的紊亂，從而有利于腫瘤細胞異常分裂增殖[10]。

線粒體蛋白smac(second mitochondria-derived activator of caspases)，又稱DIABLO（direct IAP binding protein with low PI）是2000年由美國Du等發(fā)現(xiàn)的一種新型線粒體膜間隙蛋白，由239個氨基酸前體組成，相對分子質量約26000，原蛋白約30000，是一種新發(fā)現(xiàn)的促凋亡蛋白。正常情況下，smac主要存在于細胞線粒體中，在凋亡誘導因素的前提下，線粒體同時釋放smac 和細胞色素C。smac在細胞凋亡的線粒體途徑中發(fā)揮著重要作用，它可以與IAPS的BIR結構域競爭性結合，使IAPs失去與caspase結合的能力，從而達到促凋亡的作用[11]；也可以通過增強lAP泛素連接酶的活性而降解IAP蛋白使其含量降低，從而促進細胞凋亡。

本研究結果顯示，隨著DADS濃度及作用時間的遞增，DADS對胃癌BGC823細胞的抑制率逐漸增強；將細胞周期阻滯在G2/M期。survivin和smac的表達與DADS呈劑量依賴性關系，DADS濃度越高，survivin表達越多，而smac表達減少，它們之間呈負相關，（P ＜ 0.05），這與以上survivin、smac作用機制相符合，DADS抑制腫瘤可能是通過下調survivin表達，而上調smac的表達來實現(xiàn)的?？傊b于DADS的毒性低，對多種腫瘤細胞有抑制作用，在腫瘤治療方面有一定的應用前景，深入研究它的抗癌機制，對將來DADS的臨床應用有重要意義，survivin、smac有望應用于腫瘤的靶向治療，而smac和survivin之間的關系，將為腫瘤的診療提供了新思路。

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（收稿日期：2012-02-09）