重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-S12表達(dá)頭孢菌素酰化酶的誘導(dǎo)條件優(yōu)化

摘 要:頭孢菌素酰化酶AcyⅡ可以直接水解CPC生成7-ACA，后者是重要的醫(yī)藥中間體，用來合成頭孢類抗生素。頭孢菌素酰化酶S12是AcyⅡ的突變體，其催化效率比AcyⅡ高。本文通過優(yōu)化頭孢菌素酰化酶S12在大腸桿菌BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)條件，為確定周期短、產(chǎn)率高且穩(wěn)定可靠的發(fā)酵工藝奠定基礎(chǔ)。利用單因素和正交設(shè)計(jì)對(duì)裝液量、接種量、誘導(dǎo)時(shí)間，誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度等發(fā)酵條件進(jìn)行了考察。單因素結(jié)果表明:裝液量為25ml/250ml三角瓶，接種量1%，指數(shù)生長開始加入0.05mM IPTG，28℃誘導(dǎo)20小時(shí)發(fā)酵液酶活最高;正交試驗(yàn)結(jié)果表明:裝液量50ml/250ml三角瓶，接種量2%，指數(shù)生長開始加入0.05mM IPTG，誘導(dǎo)28℃且誘導(dǎo)24hours酶活最高，發(fā)酵液產(chǎn)酶水平達(dá)639.9U/L。方差分析結(jié)果顯示，發(fā)酵時(shí)間和裝液量對(duì)酶活影響極顯著，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)酶活影響顯著，接種量對(duì)酶活沒有顯著影響。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液產(chǎn)酶水平最高可以達(dá)到802.9U/L。本實(shí)驗(yàn)為該工程菌的發(fā)酵研究提供了最佳的表達(dá)誘導(dǎo)條件，對(duì)下一步的研究具有指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞:頭孢菌素酰化酶 發(fā)酵 誘導(dǎo)條件優(yōu)化 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

中圖分類號(hào):TQ文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1674-098X(2012)04(b)-0249-02

頭孢菌素是應(yīng)用廣泛的β-內(nèi)酰胺類抗生素，是7-氨基頭孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，以下簡稱7-ACA)的衍生物，通過7-ACA來生產(chǎn)的半合成頭孢菌素占世界抗生素市場(chǎng)40％以上的份額。因此作為合成半合成頭孢菌素的重要中間體，7-ACA的研究生產(chǎn)至關(guān)重要。目前化學(xué)和酶法都可以用來從頭孢菌素C(以下簡稱CPC)生產(chǎn)7-ACA。化學(xué)法通過利用亞硝酰氯法或者硅酯裂解法從CPC化學(xué)脫酰而得，因?yàn)槭褂霉璞Ｗo(hù)基團(tuán)保護(hù)氨基和羧基，所以產(chǎn)量可以達(dá)到90％以上。但是，化學(xué)法操作復(fù)雜，對(duì)條件要求苛刻，造成生產(chǎn)上的嚴(yán)重浪費(fèi)且產(chǎn)生的副產(chǎn)品對(duì)環(huán)境有害，這些昂貴的步驟和對(duì)有毒廢料的處理都造成了生產(chǎn)成本的提高。為了克服化學(xué)法的缺點(diǎn)，有人提出了兩步酶法。如今，化學(xué)方法基本已被兩步酶法取代。頭孢菌素酰化酶就是CPC在酶法脫酰成為7-ACA過程中起到關(guān)鍵作用的酶。

現(xiàn)已報(bào)道的具有頭孢菌素酰化酶活力的菌株通常都從土壤或污水中篩選得到。與常規(guī)方法比較，利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)具有周期短、成本低、過程易于規(guī)范控制等諸多優(yōu)點(diǎn)，且由于發(fā)酵培養(yǎng)基成分簡單、酰化酶基因可受啟動(dòng)子基因調(diào)控，使其具備易純化、可誘導(dǎo)和產(chǎn)量高的特點(diǎn)。因此利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)頭孢菌素酰化酶成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

Matsuda從Pseudomonas sp．SE83中克隆了可以催化CPC脫酰為7-ACA的acyⅡ酰化酶基因，Shin通過定向進(jìn)化的方法，篩選得到一株6個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變的突變體，酶活提高到突變前的8倍，命名為S12。本實(shí)驗(yàn)室通過基因合成獲得全長目的基因，將其構(gòu)建到pET-28a表達(dá)載體上，即pET-28a-S12，在 BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)后，確定蛋白是由58kDa和25kDa大小2個(gè)亞基組成，與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)一致。酶的誘導(dǎo)表達(dá)是發(fā)酵過程的一部分，此酶在大腸桿菌中的最佳誘導(dǎo)條件至今無報(bào)導(dǎo)。本文的目的是在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上，優(yōu)化S12的誘導(dǎo)表達(dá)條件，使酶活提高，為整個(gè)發(fā)酵過程奠定基礎(chǔ)。單因素實(shí)驗(yàn)確定誘導(dǎo)表達(dá)相關(guān)參數(shù)，正交實(shí)驗(yàn)和方差分析確定相關(guān)參數(shù)的影響水平。利用正交實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)組合，酶活最高可以達(dá)到802.94U/L。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-28a-S12由上海生工構(gòu)建

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 試劑

Trypton、Yeast extract、瓊脂粉:北京奧博星生物技術(shù)有限公司;氯化鈉、PDAB(對(duì)二甲氨基苯甲醛)、無水甲醇(分析純)、葡萄糖:北京化學(xué)試劑廠;丙烯酰胺、IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、卡那霉素、β-疏基乙醇:Amresco公司;冰乙酸(優(yōu)級(jí)純):國藥集團(tuán);SDS(十二烷基硫酸鈉)、Tris:Sigma;蛋白低分子量標(biāo)準(zhǔn):購于TaKaLa。

1.2.2 儀器

高速離心機(jī)DL-16B，電泳儀 ECP3000，電泳槽DY-CY31A，Y92-1超聲波破碎儀，振蕩培養(yǎng)箱ZDP-250，電熱恒溫培養(yǎng)箱 DNP-9272，電子天平TA5002，分光光度計(jì)Unico2100，酸度計(jì)HANNA HI 221。

1.3 菌種活化

挑取1環(huán)-80℃甘油凍存的工程菌，在LB固體培養(yǎng)基中(卡那霉素50ug/ml)劃線培養(yǎng)過夜，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中(卡那霉素50ug/ml)培養(yǎng)過夜。

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)

選用LB培養(yǎng)基，采用單因素實(shí)驗(yàn)測(cè)定葡萄糖、裝液量、接種量、培養(yǎng)時(shí)間、誘導(dǎo)劑(IPTG)濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度對(duì)發(fā)酵液酶活的影響，以菌體破碎后的粗酶液的酶活高低為原則確定各單因素下最適條件，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 目的蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

將誘導(dǎo)后的菌體4℃、12000r/min離心5min搜集菌體，將菌體重懸于Tris緩沖液中，冰浴中超聲波破碎(40W、工作5s、間歇 5s、30次)，4℃、12000r/min離心15min，取上清液并將沉淀溶于Tris緩沖液中，12%的SDS-PAGE凝膠電泳鑒定。

1.6 酶活測(cè)定

參見Lee等的研究方法，取0.5ml粗酶液，加入0.5ml底物(用pH8.0 Tris緩沖液配配制20%CPC)，37℃水浴8min，加入3ml終止液和0.5ml顯色液。振蕩混勻后靜置15min，12000rpm離心5min。取上清液于415nm處測(cè)定光吸收值。空白對(duì)照為先加終止液，后加底物。37℃、1min生成1μmol 7-ACA定義為1個(gè)酶活單位(U)。

1.7 搖瓶發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)優(yōu)化

采用正交試驗(yàn)法將對(duì)發(fā)酵液酶活有影響的單因素進(jìn)行組合，按L16(45)正交表安排正交試驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理進(jìn)行3次重復(fù)，取平均值。通過對(duì)結(jié)果的極差分析，確定最優(yōu)組合。通過方差分析確定四因素影響顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖對(duì)發(fā)酵液酶活和蛋白表達(dá)量的影響

250ml搖瓶內(nèi)分別裝100ml LB、100ml LBG(LB+0.5%葡萄糖)，37℃，初始pH為7.2，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，接種量1%，4h后，加入0.05mM IPTG，誘導(dǎo)4h，結(jié)果表明，LBG的發(fā)酵液酶活比LB的發(fā)酵液酶活低，其外源蛋白的表達(dá)量卻高于LB。

LB是一種營養(yǎng)豐富的半合成培養(yǎng)基，基本具備了大腸桿菌生長所需要的全部營養(yǎng)元素，葡萄糖是容易被微生物利用的碳源，希望借添加葡萄糖來提高發(fā)酵液酶活，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加葡萄糖后表達(dá)量提高，發(fā)酵液酶活降低了，這與野生菌發(fā)酵產(chǎn)酶的規(guī)律是不一樣的，推斷是因?yàn)檎T導(dǎo)表達(dá)的胞內(nèi)酶量大時(shí)，會(huì)使外源蛋白不能及時(shí)實(shí)現(xiàn)正確的折疊，導(dǎo)致可溶性粗酶蛋白液中存在很大部分折疊介于完全正確和完全不正確的結(jié)構(gòu)的蛋白，雖然表達(dá)總酶量上升了，但有效酶量卻減少了，導(dǎo)致酶活降低，所以葡萄糖的加入不能使此工程菌表達(dá)出具有高發(fā)酵液酶活的酰化酶。

2.2 種子培養(yǎng)時(shí)間的確定

種子培養(yǎng)時(shí)間即種齡，對(duì)大腸桿菌發(fā)酵過程的影響較大。適宜的種齡應(yīng)是菌種對(duì)數(shù)生長的中后期，此時(shí)的種子具有較強(qiáng)的生長活力，而且菌體濃度相對(duì)較高，有利于大腸桿菌的迅速積累。由菌種的生長曲線可知，2h以內(nèi)是遲滯期，此時(shí)菌體為自身進(jìn)行各種物質(zhì)合成和分解做著準(zhǔn)備。2h進(jìn)入指數(shù)生長期，8h菌種正處于指數(shù)生長中后期，菌濃度較高，菌體生長旺盛，因此選擇種子培養(yǎng)時(shí)間為8h。

2.3 接種量對(duì)發(fā)酵液酶活的影響

接種量的大小對(duì)發(fā)酵周期的長短和發(fā)酵水平的高低有一定的影響。接種量太小，菌種增殖緩慢，培養(yǎng)時(shí)間延長，會(huì)造成菌絲結(jié)塊等發(fā)酵異常，不利于菌體生長和產(chǎn)酶;而接種量過大，會(huì)使菌種生長過快，培養(yǎng)基黏度增加，導(dǎo)致基質(zhì)消耗過快，溶氧不足，菌種容易衰老，也不利于產(chǎn)酶。因此，應(yīng)采用適合的接種量，在合理地縮短發(fā)酵周期的同時(shí)，又能得到較高的發(fā)酵水平。將培養(yǎng)8h的新鮮種子按 0.1%、0.3%、0.5%、1%、2%和5%的接種量分別接入培養(yǎng)基中，接種量以1%或2%為好，此時(shí)發(fā)酵液酶活較高;接種量超過2%，對(duì)酶活有一定的抑制。

2.4 裝液量對(duì)發(fā)酵液酶活的影響

搖瓶裝液量與溶解氧濃度有關(guān)，所以對(duì)發(fā)酵水平的高低有一定的影響。裝液量太小，設(shè)備利用率低，增加工業(yè)投入成本;而裝液量過大，培養(yǎng)液中溶解氧少，菌種容易衰老，不利于產(chǎn)酶。因此，采用適合的裝液量，能得到較高的發(fā)酵水平。以250ml搖瓶，分別盛放25ml、50ml和100ml培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)25ml培養(yǎng)基對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶效果最好，隨著培養(yǎng)基的增多，對(duì)酶活有一定的抑制。

2.5 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)發(fā)酵液酶活的影響

將8小時(shí)的種子液按1%接種于新鮮培養(yǎng)基中，測(cè)定其生長曲線，從生長曲線我們可以推斷，工程菌在不同的生長時(shí)期，其表達(dá)的酶活一定存在差異。所以本文選取不同的生長時(shí)期加入IPTG，發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)接后2h，即指數(shù)生長開始是最佳的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。

2.6 誘導(dǎo)溫度對(duì)發(fā)酵液酶活的影響

加入終濃度為0.05mmol/L的IPTG后，分別設(shè)定溫度為16℃、20℃、25℃、28℃和37℃，誘導(dǎo)，在溫度為28℃時(shí)發(fā)酵液酶活最高，因此誘導(dǎo)表達(dá)的最佳溫度可以確定在 28℃。

對(duì)于工程菌，一般采用菌體生長階段和產(chǎn)物生成階段的2階段發(fā)酵模式，不同的階段有不同的目的，因此培養(yǎng)溫度也要隨之改變。前期優(yōu)先促進(jìn)菌體生長，以獲得足夠的生物量，后期以目的蛋白表達(dá)為主，溫度要適當(dāng)調(diào)整，適宜的溫度可以促進(jìn)外源蛋白的表達(dá)，否則會(huì)抑制。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)誘導(dǎo)溫度為28℃時(shí)，酶活最高，當(dāng)溫度過高或過低時(shí)酶活都降低。可能由于溫度過低時(shí)菌體生長代謝緩慢，蛋白表達(dá)受抑制，當(dāng)溫度過高時(shí)菌體自身蛋白表達(dá)占上風(fēng)，外源蛋白表達(dá)受抑制。

2.7 IPTG濃度對(duì)發(fā)酵液酶活的影響

1%接種后4小時(shí)開始添加IPTG，終濃度為0.01mmol/L、0.05mmol/L、0.5mmol/L、和1.0mmol/L，28℃誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果表明，當(dāng)IPTG濃度為0.05mmol/L時(shí)發(fā)酵液酶活最高，當(dāng)IPTG濃度升高為1.0mmol/L時(shí)酶活降低，可能由于IPTG濃度過高對(duì)菌體產(chǎn)生了毒害作用。

外源基因克隆在含有l(wèi)ac啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)中，lacI產(chǎn)生的阻遏蛋白與lac操縱基因結(jié)合抑制下游的外源基因轉(zhuǎn)錄，便可以實(shí)現(xiàn)宿主菌生長，向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物 IPTG(異丙基硫代-D-半乳糖)，解除lacI抑制使外源基因大量表達(dá)。但是當(dāng)IPTG濃度過高時(shí)會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生毒害作用，抑制外源蛋白表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，搖瓶中0.05mmol/L的IPTG就足以誘導(dǎo)啟動(dòng)子完全開放，這對(duì)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中降低發(fā)酵成本有積極意義。

2.8 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目的基因表達(dá)水平的影響

在搖瓶培養(yǎng)到指數(shù)生長開始時(shí)，加入0.05mmol/L IPTG，28℃分別誘導(dǎo)2h、4h、6h、8h、10h、12h和20h，發(fā)酵液酶活隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長而提高，當(dāng)達(dá)到20h時(shí)酶活穩(wěn)定。結(jié)果如圖10表明，菌體處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，生長速度較快，外源蛋白有少量表達(dá)，當(dāng)進(jìn)入到誘導(dǎo)狀態(tài)后，生長速度下降，以表達(dá)外源蛋白為主，當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間后，發(fā)酵液中營養(yǎng)的消耗，氧氣的缺乏使得菌體的生長進(jìn)入平臺(tái)期，即產(chǎn)生和自溶互相抵銷，影響了外源蛋白的積累。

2.9 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由極值的變化推知，各因素的重要性依次為誘導(dǎo)時(shí)間、裝液量、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和接種量。最優(yōu)誘導(dǎo)條件為:誘導(dǎo)時(shí)間24h、裝液量50ml、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)是在轉(zhuǎn)接后2h、接種量是2%，最佳組合為A2B2C2D3。方差分析結(jié)果表明，發(fā)酵時(shí)間和裝液量對(duì)酶活有極顯著影響，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)酶活有顯著影響，接種量對(duì)酶活沒有影響。

為提高統(tǒng)計(jì)分析的可靠性，給出了對(duì)正交試驗(yàn)得出的較優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證的兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果。與正交試驗(yàn)中A2B2C2D3發(fā)酵液酶活639.9U/L相比，驗(yàn)證組合A2B2C2D3的發(fā)酵液酶活提高了25%。

3 結(jié)論

本文對(duì)工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-S12的誘導(dǎo)條件進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葡萄糖對(duì)產(chǎn)酶水平有顯著的影響，接種量、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑的濃度對(duì)菌體的產(chǎn)酶有影響，最佳的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為菌體培養(yǎng)4h，處于對(duì)數(shù)生長前期(OD600≈1.5)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的重組大腸桿菌的發(fā)酵在對(duì)數(shù)生長末期誘導(dǎo)有差異，與廖美德等報(bào)道的在對(duì)數(shù)生長前中期接近。誘導(dǎo)劑IPTG添加量影響菌體生長和外源基因的表達(dá)，這與Babu等的報(bào)道相同，當(dāng)IPTG濃度0.05mmol/L誘導(dǎo)效果最好。方差分析結(jié)果表明，發(fā)酵時(shí)間和裝液量對(duì)酶活有極顯著影響，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)酶活有顯著影響，接種量對(duì)酶活沒有影響。最優(yōu)組合誘導(dǎo)條件為:誘導(dǎo)時(shí)間24h、裝液量50ml、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)是在轉(zhuǎn)接后2h、接種量是2%，酶活達(dá)到639U/L。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液產(chǎn)酶水平最高達(dá)802.94U/L，沒有達(dá)到1207U/L，推測(cè)是與表達(dá)載體和誘導(dǎo)方法有關(guān)，如文獻(xiàn)中使用乳糖作為誘導(dǎo)劑，一方面起到誘導(dǎo)作用，一方面可以作為碳源，在今后的高密度發(fā)酵研究中，考慮引用乳糖作為碳源和誘導(dǎo)物。外源蛋白的表達(dá)是發(fā)酵過程的重要組成部分，合適的誘導(dǎo)條件可以使發(fā)酵產(chǎn)物達(dá)到最大。具體發(fā)酵工藝今后研究。

參考文獻(xiàn)

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