156例兒童急性白血病免疫分型研究

[摘要] 目的 研究兒童急性白血病免疫分型特點，了解兒童急性白血病抗原表達規(guī)律和免疫亞型分布情況。 方法 采用CD45/SSC雙參數設門方法的三色流式細胞術檢測白血病細胞膜表面及胞漿內分化抗原。 結果 156例兒童急性白血病免疫可分為4類：未分化型占0.7%，急性淋巴細胞白血病69.2%，急性髓細胞白血病25%，急性混合型白血病5.1%。108例兒童ALL中，B淋巴細胞白血病（B-ALL）占90.7%，T淋巴細胞白血病占9.3%，CD10、CD19、CD20在B-ALL中表達較高，陽性率分別為83.5%、98.9%、21.6%。CD13、CD33、CD117、胞漿內MPO在AML各亞型中有較高的表達率，陽性率分別為94.8%、94.8%、67.6%、86.5%，AML-M3患者CD34及HLADR呈低表達，均明顯低于其他髓系白血病，差別有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）。 結論 免疫分型技術在兒童急性白血病患者診斷中具有重要意義，是骨髓形態(tài)學診斷的有力補充。

[關鍵詞] 兒童急性白血病；免疫分型；流式細胞術

[中圖分類號] R733.71 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2012）36-0096-03

白血病免疫分型是利用流式細胞儀檢測與熒光標記的單克隆抗體特異性結合的白血病細胞表面或胞漿內抗原的方法，能夠更細致地分析正常和惡性細胞系列來源，分析被測細胞的分化階段，從而有助于臨床分型、指導治療及判斷預后的重要手段，彌補了傳統(tǒng)的白血病骨髓常規(guī)檢查的不足，是對細胞形態(tài)學診斷急性白血病（acute leukemia，AL）的重要補充。本研究回顧性分析2008年1月～2012年6月入住我院的156例初發(fā)兒童急性白血病患者免疫分型結果，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2008年1月～2012年6月在溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院兒童血液科初診的急性白血病患者156例，男93例，女63例，中位年齡6歲（1個月～16歲）。所有病例均按《白血病診斷及療效標準》[1]確診。

1.2 儀器與試劑

所用儀器為美國BD公司生產的FACS CantoⅡ流式細胞儀，單克隆抗體均為BD公司生產，包括T淋系標記CD2、CD3、CD4、CD5、CD7，B淋系標記CD10、CD19、CD20，髓系標記CD13、CD14、CD15、CD33、CD117、胞漿內MPO，干/祖細胞標記HLADR、CD34等。

1.3 方法

所有標本均為肝素抗凝的骨髓液，據骨髓增生情況取骨髓液10～50 μL，調細胞濃度為1×106/L。取BD流式試管11只，每管分別加入相應的單克隆抗體10 μL、CD45-PE-Cy5 5 μL，室溫暗室反應30 min，加入溶血劑1 mL，室溫靜置15 min，500 g離心5 min，棄上清，加入PBS緩沖液使細胞終濃度在1×106/L左右，上機測定。采用CD45/SSC雙參數設門方法檢測，結果用FACS Diva Software分析軟件。

1.4 結果判讀

T淋系標記以≥30%為陽性；B淋系標記及髓系標記以≥20%為陽性，胞漿內MPO以≥10%為陽性。

1.5 免疫表型判斷標準

根據歐洲白血病免疫學分型研究組（EGIL）[2]提倡的抗原積分系統(tǒng)分為未分化型、單純型、變異型、混合型。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0軟件分析，率的比較用χ2檢驗，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 白血病免疫分型情況

156例兒童AL患者免疫分型中，ALL 108例（69.2%），其中B-ALL 98例（90.7%），T-ALL 10例（9.3%），AML 39例（25%），急性混合細胞性白血病8例（5.1%），未分化型1例（0.7%）。

2.2 ALL患者抗原表達情況

按照急性混合細胞白血病診斷積分系統(tǒng)（EGIL，1994），表1中B-ALL患者其CD10、CD19、CD20陽性率分別為83.5%、98.9%、21.6%，以CD19最高，T-ALL患者CD2、CD3、CD5、CD7陽性率分別為72.7%、18.2%、90.9%、100%，以CD7陽性率最高，伴髓系抗原ALL患者中CD13、CD33陽性率分別為87.6%、9.3%。見表1。

2.3 兒童AML組患者髓系及造血干/祖細胞標記抗原表達情況

由表2可知，39例兒童AML患者CD13、CD33、CD117、cMPO陽性率分別為94.9%、94.9%、64.1%、86.5%；cMPO在M2、M3、M4、M6中表達率較高，分別為100%、100%、90%、100%，而在M5病例中表達相對較低（53.8%），CD14、CD15在AML患者中的表達率分別為10.3%、43.5%，而在M4、M5中表達最高，分別占75%（3/4例）、82.4%（14/17例）；CD34、HLADR在AML-M3中表達率分別為18.2%、0，均明顯低于M2、M4、M5、M6組患者的表達，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=15.386，P ＜ 0.05）、（χ2=27.073，P ＜ 0.05）。CD7陽性AML占15.4%，CD19陽性AML占25.6%。

3 討論

急性白血病是起源于造血干細胞的惡性克隆性疾病，具有高度的異質性，其正確診斷對確定治療方案、判斷預后觀察療效具有重要意義。白血病是造血細胞的某一克隆被阻滯在某一分化階段上并異常增殖的結果，故白血病細胞往往停滯在細胞分化的某一抗原表達階段，因此可利用單克隆抗體檢測相應白細胞表面抗原或胞質內的分化抗原進行白血病類型、細胞發(fā)育階段的鑒別，從而指導治療、判斷預后，傳統(tǒng)的白血病分型主要根據FAB分型，以細胞形態(tài)學和細胞化學染色為依據，其診斷符合率僅有60%～80%[3]。

本研究中，利用CD45/SSC雙參數散點圖設門方法將骨髓細胞清楚地分群，CD45為人類白細胞抗原，在細胞表面的表達量與細胞分化程度有關。其表達水平：淋巴細胞＞單核細胞＞中性粒細胞＞原始細胞。幼紅細胞不表達。根據SSC和CD45表達量的不同，可以特異地分析白血病細胞，增加了白血病免疫分型的準確度與靈敏度。

通過對156例兒童急性白血病患者的免疫分型，ALL患者占69.2%，其中B-ALL占90.7%，T-ALL占9.3%，與廖寧等[4]報道結果一致，而高于沈紅強等[5]報道的結果。而39例AML患者，最常表達CD13、CD33、CD117、胞漿內MPO，故利用流式細胞術檢測白血病免疫分型能夠區(qū)分90%以上AML和ALL，并發(fā)現AUL 1例、雜合型白血病8例（5.1%），后者與國內外文獻報道接近[5-7]，說明它們是髓系較為敏感的抗原。CD117主要表達于造血祖細胞、不成熟的粒細胞和肥大細胞，大多數AML中的原始細胞均有CD117表達。胞漿內MPO表達于粒細胞的嗜苯胺藍顆粒中，在循環(huán)單核細胞中低密度存在。某些AML的原始細胞也有表達，本研究中有2例M5患者胞漿內MPO為陰性，同時細胞化學染色POX亦為陰性，提示MPO作為髓系抗原的特異性指標對急性粒細胞白血病敏感性更高。其中CD13和CD33也表達于急性淋巴細胞白血病[8]，本研究中急性淋巴細胞白血病患者CD13、CD33表達率分別為87.6%、9.3%。CD13遠高于國內其他地區(qū)報道的結果，可能與地域有關，提示CD13、CD33雖然是髓系標記，但不能單獨作為判斷急性淋巴細胞白血病與急性髓細胞白血病的指標，必須與其他指標相結合才能得出結論。

本研究中，39例AML髓系相關抗原CD13、CD33表達率均為94.8%，CD34和HLADR均為干/祖細胞相關抗原，是非系列相關性抗原，原始細胞表達CD34和HLADR，11例兒童急性早幼粒細胞白血病CD34和HLADR陽性率分別為18.2%（2/11）、0（0/11），明顯低于AML其他亞型中的陽性率，提示CD34、HLADR陰性在AML-M3診斷中有重要價值。CD14是單核細胞的最好標志，CD15表達于除原粒細胞以外的所有粒細胞、多數單核細胞，本研究中M4、M5患者CD14、CD15的表達率分別占75%（3/4）、82.4%（14/17），高于其他亞型的AML患者表達率，對M4、M5的診斷有一定的提示意義。本研究中39例AML患者CD7陽性表達率為15.4%，CD19陽性表達率為25.6%，與Webber等[9]報道結果相似，提示兒童AML患者以CD19、CD7伴系表達最為常見。

綜上，通過對156例兒童急性白血病進行免疫分型可知，白血病免疫分型能夠彌補FAB分型的不足，準確地將ALL分為T-ALL和B-ALL，同時有助于AML亞型的判斷，有效地彌補了形態(tài)學分型存在的較大的主觀性以及受檢驗者水平參差不齊的影響，是FAB分型的有效補充，提高了分型的準確性，由于白血病細胞具有跨系表達、時相混亂、抗原表達量改變及出現分化阻滯等特點[10]，不能完全取代形態(tài)學分型，必須結合FAB分型才能更加科學準確地診斷急性白血病，為臨床診斷和治療提供依據。

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（收稿日期：2012-09-03）