XAGE—1b mRNA在肝癌患者血液中的表達(dá)

[摘要] 目的 探討原發(fā)性肝癌外周血液中XAGE-1b mRNA的表達(dá)意義。 方法 采集86例原發(fā)性肝癌患者靜脈血，實(shí)時熒光定量PCR檢測其中XAGE-1b mRNA的表達(dá)。 結(jié)果 原發(fā)性肝癌患者血液中XAGE-1b mRNA檢出率為80.8%。 結(jié)論 XAGE-1b mRNA可作為一種腫瘤標(biāo)志物診斷原發(fā)性肝癌。

[關(guān)鍵詞] 肝癌；XAGE-1bmRNA

[中圖分類號] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2012）36-0038-02

CT抗原是一類在除睪丸、胎盤等以外的正常組織中幾乎不表達(dá)的抗原，但可在多種腫瘤組織中表達(dá)。XAGE-1是通過生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)的一種新的CT抗原，且具有類似CT抗原的特性[1]。研究發(fā)現(xiàn)在肺癌、黑色素瘤、前列前癌等癌組織中均有較高的XAGE-1檢出率，并且揭示了XAGE-1的表達(dá)與腫瘤亞型間的關(guān)聯(lián)[2]。本研究采用實(shí)時熒光定量PCR（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）檢測了原發(fā)肝癌患者靜脈血中ＸＡＧＥ－１ｂ mRNA的表達(dá)，并對其表達(dá)的意義進(jìn)行探討，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集我院2006年8月～2011年5月接受原發(fā)性肝癌切除術(shù)的患者86例，其中男 71例。女 15例，年齡30～69歲。所有患者均經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)，其中肝細(xì)胞癌79例，膽管細(xì)胞癌7例，大肝癌49例，小肝癌37例，甲胎蛋白（AFP）陽性62例，陰性24例。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

術(shù)前采集患者周圍靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，4℃保存。6h內(nèi)抽提血液總RNA。使用QLAamp RNA Blood Mini試劑盒（德國QLAGEN公司生產(chǎn)）處理血液樣本并提取樣本中的RNA，以12%瓊脂糖凝膠電泳抽樣檢驗(yàn)其質(zhì)量。提取出RNA后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（立陶宛Fermentas公司）制備ｃＤＮＡ，以ｃＤＮＡ為模板進(jìn)行ＰＣＲ反應(yīng)，反應(yīng)在Ftc2000熒光定量PCR儀（上海楓嶺生物科技有限公司）上進(jìn)行。總反應(yīng)體系20 μL，其中探針（20 mmol/L）0.5 μL，引物（20 mmol/L）0.9 μL，Mix10 μL（ＰＣＲ試劑盒，日本Ｔｏｙｏｂｏ公司），血液樣品cDNA2 μL，H20補(bǔ)至20 μL，每個樣品的目的基因與內(nèi)參基因各設(shè)3個重復(fù)實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性60 s，94℃變性30 s，60℃退火，延伸及讀板60 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參基因。XAGE-1b上游引物5’-GCTGAAAGTCGGGATCCTACA-3’，下游引物5’-CTTCCATGTCGCGCACTG-3’，探針5’（ＴＥＴ）-CTGGGCAGC-AGACAG-3’（MGB）；GAPDH上游引物5’-GGGCTGCTTT-TAACTCTGGTAAAG-3’，下游引物5’-CCATGGGTGGAATCATATTGG-3’，探針5’（FAM）-CCTＣＡＡＣＴＡＣＡＴＧＧＴＴＡＣ－３’（ＭＧＢ）。每次反應(yīng)均設(shè)置空白對照組及用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的6個梯度的標(biāo)準(zhǔn)樣品反應(yīng)混合物，標(biāo)準(zhǔn)樣品反應(yīng)混合物由復(fù)旦大學(xué)病毒與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備提供。PCR反應(yīng)結(jié)束后，儀器電腦軟件自動生成以標(biāo)準(zhǔn)樣品基因拷貝數(shù)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，以各拷貝數(shù)對應(yīng)的ct值為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)坐標(biāo)曲線，XAGE-1b及GAPDH的拷貝數(shù)均有各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，ct值取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的算術(shù)平均值，以各自樣本的XAGE-1b拷貝數(shù)與GAPDH拷貝數(shù)的比值來表示XAGE-1b的表達(dá)水平。甲胎蛋白檢查方法采用實(shí)驗(yàn)室電化學(xué)發(fā)光方法。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SAS 6.12統(tǒng)計學(xué)軟件，采用χ2檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 XAGE-1b的表達(dá)與患者性別、年齡的關(guān)系

男性患者的標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)率為80.8%，女性患者的標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)率為78.4%，兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.222，P > 0.05），30～39歲組（29例，陽性26例）、40～59歲組（27例，陽性21例）和60歲以上組（30例，陽性25例）表達(dá)率分別為90.0℅、77.8%和83.3%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.535，P > 0.05）。

2.2 XAGE-1b mRNA的表達(dá)量與臨床病理因素之間的關(guān)系

XAGE-1b mRNA的表達(dá)量在大肝癌與小肝癌之間、肝細(xì)胞癌與膽管細(xì)胞癌之間的差異無相關(guān)性，其表達(dá)與腫瘤大小、病理類型、疾病進(jìn)展無相關(guān)性（P > 0.05）。

2.3 XAGE-1b mRNA的表達(dá)水平與AFP的關(guān)系

檢測結(jié)果提示，XAGE-1b mRNA的檢出率明顯高于AFP的檢出率（80.8% vs 72.1%），且一致性檢測顯示二者不具有相關(guān)性。

3 討論

隨著手術(shù)及放化療等輔助治療措施的開展，肝癌患者的預(yù)后已有所改善，但仍有很多患者死于肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。如何在病程早期發(fā)現(xiàn)和診斷轉(zhuǎn)移，尤其是早期診斷微轉(zhuǎn)移對于調(diào)整治療方案、改善患者預(yù)后具有十分重要的意義。目前，腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白（AFP）作為診斷肝細(xì)胞癌的首選指標(biāo)，雖然可使原發(fā)肝癌獲得早期診斷[3]，但仍有30%～40%的肝細(xì)胞癌患者血清AFP呈陰性[4]。為此，眾多研究者都在尋找對原發(fā)性肝癌敏感而特異的診斷指標(biāo)，試圖通過血中標(biāo)志物和切除標(biāo)本進(jìn)行檢測，實(shí)現(xiàn)原發(fā)性肝癌的早期診斷和預(yù)后判斷。國外學(xué)者對XAGE-1b在原發(fā)性肝癌的表達(dá)進(jìn)行研究，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)在體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞癌系中發(fā)現(xiàn)了XAGE-1b mRNA的表達(dá)。國內(nèi)學(xué)者通過對肝癌患者腫瘤組織中的ＸＡＧＥ－１基因進(jìn)行了檢測，其結(jié)果顯示，XAGE-1b mRNA在肝癌組織中大量表達(dá)，且XAGE-1b mRNA的表達(dá)與患者的性別、年齡、是否合并有HBV感染、肝硬化、術(shù)前甲胎蛋白水平、腫瘤直徑、病理組織學(xué)分型以及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P ＞ 0.05），但與腫瘤的TNM分期有明顯關(guān)聯(lián)（P < 0.05）[5]。

另有研究揭示，XAGE-1b mRNA是一種良好的腫瘤標(biāo)志物，它敏感性高，尤其對AFP陰性的肝癌更具有診斷價值，并能良好地區(qū)分原發(fā)性肝癌、肝硬化、良性肝病，一定程度上彌補(bǔ)了AFP診斷原發(fā)性肝癌的不足[6]。本文研究結(jié)果顯示，原發(fā)性肝癌患者外周血XAGE-1b mRNA的檢出率高達(dá)80.8%，其表達(dá)與年齡、性別無關(guān)，表達(dá)量與腫瘤大小、病理類型、臨床分期無關(guān)，說明它是一個良好的腫瘤分子標(biāo)志物，不僅可以預(yù)測血液中腫瘤細(xì)胞的微轉(zhuǎn)移，且在肝癌的診斷上也顯示出陽性率高的優(yōu)勢。同時研究發(fā)現(xiàn)，AFP陰性肝細(xì)胞癌XAGE-1b mRNA表達(dá)率為82.4%，而且AFP與XAGE-1b mRNA的表達(dá)不具有相關(guān)性，這在很大程度上彌補(bǔ)了AFP陽性率方面的缺陷。因此，我們認(rèn)為AFP與XAGE-1b mRNA聯(lián)合檢測或許是提高肝癌診斷水平的較好方法。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2012-11-15）