miR—124抑制胃癌MKN—45細胞的侵襲與轉移

[摘要] 目的 探討miR-124對胃癌細胞MKN-45侵襲能力的影響。 方法 使用脂質體將miR-124 mimics轉染MKN-45細胞，以無關序列（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｍｉｍｉｃｓ）作為陰性對照。采用細胞劃痕實驗觀察miR-124過表達對胃癌細胞MKN-45侵襲能力的影響。 結果 細胞劃痕實驗顯示，轉染miR-124 mimics 24 h、48 h后傷口愈合率分別為（０．３１３±０．００５）、（０．３６９±０．０３１），與各自對照組（０．４１３±０．０３５）、（０．８５２±０．０２４）比較能明顯減緩MKN-45細胞劃痕傷口的愈合，差異有統計學意義（Ｐ ＜ ０．０５）。 結論 miR-124能抑制胃癌細胞侵襲能力，它可能在胃癌的發生和進展中發揮重要作用。

[關鍵詞] 胃癌；miR-124；侵襲與轉移

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] Ａ [文章編號] 1673-9701（2012）36-0001-02

miRNA 發揮癌基因和抑癌基因的功能參與細胞增殖、凋亡和分化的調控，在腫瘤的發生發展過程中發揮著重要的生物學功能[1]。目前有關miR-124的研究報道不多，研究發現miR-124在肝癌和宮頸癌組織或細胞中表達下調[2-3]，miR-124在胃癌組織中表達下調，且與胃癌的臨床分期、分化程度以及淋巴結轉移相關[4]。miR-124可通過靶向CDK6抑制髓母細胞瘤細胞的生長與浸潤[5]，但目前miR-124在胃癌等腫瘤中的確切生物學功能并不清楚。本研究通過在胃癌細胞中轉染miR-124 mimics使miR-124高表達，探討miR-124對胃癌細胞侵襲和轉移能力的影響，從而初步揭示miR-124在胃癌中生物學功能。

1 材料與方法

1.1 主要材料

胃癌細胞系MKN-45為本院臨床研究所保存。Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司。Trizol試劑從Invitrogen公司購買。miR-124 mimics為上海吉瑪公司產品。RPMI1640培養基購自Hyclone公司。MTS細胞增殖/毒性檢測試劑盒購自美國Sigma公司。

1.2 細胞轉染

轉染前1 d將MKN-45細胞接種于6孔板中，待貼壁細胞融合度達40%～60%時準備轉染，轉染時去掉原培養基，用RPMI1640培養液（無血清）洗2遍。取4 μL lipofectamine2000脂質體加入500 μL無血清RPMI1640培養液中，同時取10 μL miR-124 mimics儲存液加入500 μL無血清RPMI1640培養基中，室溫靜置5 min，然后將兩者混合室溫靜置20 min后。將此混合液加入細胞中，mimics的最終濃度為80 nmol/L，6 h后更換含10%胎牛血清DMEM培養基，繼續擴大培養以用于后續實驗。

1.3 細胞劃痕實驗

將瞬時轉染miR-124 mimics和無關序列的細胞接種于6孔板待之長至臨近飽和；用10 μL Eppendorf Tip消毒后在細胞板上劃痕，并將細胞洗滌2～3遍；加5％小牛血清的RPMI1640培基，倒置顯微鏡觀察0 h， 24 h， 48 h各組細胞的變化，并于倒置顯微鏡攝像；軟件測量轉染細胞任意三個部位的不同傷口的寬度，計算各處理組傷口愈合率，測量各組細胞任意三個部位的不同傷口的寬度，通過測算0 h，24 h與48 h的傷口愈合率，即用0 h傷口寬度與24 h，48 h時間傷口寬度的差值與0 h傷口寬度的比值。計數三組實驗的平均值，并進行統計學分析。

2 結果

細胞劃痕實驗檢測miR-124對胃癌MKN-45細胞運動侵襲能力影響見圖1。在6孔板通過轉染miR-124 mimics及其對照胃癌MKN-45細胞，過夜細胞貼壁后進行細胞劃痕實驗，通過測算0 h，24 h與48 h的傷口愈合率，其愈合率=（0 h傷口寬度-實驗時間傷口寬度）/（0 h傷口寬度）。結果顯示，轉染ｍｉＲ－１２４ ｍｉｍｉｃｓ ２４ ｈ、４８ ｈ后傷口愈合率分別為（０．３１３±０．００５）、（０．３６９±０．０３１），與各自對照組（０．４１３±０．０３５）、（０．８５２±０．０２４）比能明顯減緩ＭＫＮ－４５細胞劃痕傷口的愈合，差異有統計學意義（Ｐ ＜ ０．０５）（圖１），結果提示，高表達ｍｉＲ－１２４對ＭＫＮ－４５細胞運動能力有抑制作用。

3 討論

近年來，通過高通量的miRNA芯片篩選等方法已發現大量miRNA與胃癌相關，但是迄今為止對這些miRNA在胃癌發生發展的確切功能及其機制知之甚少。miRNA的表達失調或功能異常可能導致包括腫瘤在內的多種疾病的發生。越來越多的研究顯示在人類腫瘤中存在miRNA表達的失調，miRNA 發揮癌基因和抑癌基因的功能參與細胞增殖、凋亡和分化的調控，在腫瘤的發生發展過程中發揮著重要的生物學功能[1]。Ghanta等[6]通過自己建立的人類miRNA疾病數據庫整理出幾十個致瘤miRNA和抑瘤miRNA，并對其功能、表達、進化、基因組分布、靶基因及轉錄因子等進行了全面的系統生物學分析，發現在功能上致癌miRNA更傾向于促進細胞增殖、抑制凋亡、抑制免疫細胞發育、控制細胞周期等，而抑癌miRNA更傾向于抑制細胞生長、促進凋亡等。關于miRNA可作為瘤基因或抑瘤基因參與腫瘤的發生發展的報道越來越多。本研究通過細胞劃痕實驗檢測發現高表達miR-124對MKN-45細胞增殖的影響。結果發現，與scramble mimics細胞相比，轉染miR-124 mimics的MKN-45細胞從24 h起運動侵襲速度明顯減慢，差異有統計學意義（P < 0.05），表明miR-124能抑制胃癌細胞運動侵襲，它可能在胃癌發生、發展中起著重要的作用。

通過在線軟件預測尋找miR-124作用的靶基因發現，miR-124的許多潛在靶基因如SPHK1、E-cadherin、CDK6等與腫瘤細胞增殖，粘附，遷移過程有關，miR-124可通過調控這些靶基因來發揮抑制胃癌細胞運動侵襲的功能。當然，尚有待于進一步的實驗驗證。闡明miR-124在胃癌發生發展中的作用對于認識胃癌發生的機制，探索新的有效的胃癌診斷預后評價標志物及治療方法，具有重要的科學意義。

[參考文獻]

[1] Tang H，Wang Z，Liu X，et al. LRRC4 inhibits glioma cells growth and invasion by miR-185 mediating pathway[J]. Curr Cancer Drug Targets，2012，12（8）：1032-1042.

[2] Wilting SM，Van Boerdonk RA，Henken FE，et al. Methylation-mediated silencing and tumour suppressive function of hsa-miR-124 in cervical cancer[J]. Mol Cancer，2０１０，９：１６７．

[3] Furuta M，Kozaki KI，Tanaka S，et al. miR-124 and miR-203 are epigenetically silenced tumor-suppressive microRNAs in hepatocellular carcinoma[J]. Carcinogenesis，2010，31（5）：766-776.

[4] Li KK，Pang JC，Ching AK，et al. miR-124 is frequently down-regulated in medulloblastoma and is a negative regulator of SLC16A1[J]. Hum Pathol，200９，４０（９）：１２３４－１２４３．

[5] 呂輝，唐云云，唐海林，等． miR-124在胃癌中的表達及其臨床意義[J]．醫學臨床研究，２０１２，２９（３）：３８８－３９０．

[6] Ghanta KS，Li DQ，Eswaran J，et al. Gene profiling of MTA1 identifies novel gene targets and functions[J]. Plｏ Ｓ Ｏｎｅ，２０１１，６：ｅ１７１３５．

（收稿日期：2012-11-15）