蚯蚓洗滌液防治月季灰霉病的初步機理研究

　　引言
　　月季是薔薇科薔薇屬多年生木本植物，是著名的四大切花之一，近年來已經成為花卉主栽品種。但是近年來，月季灰霉病已成為1種世界性的嚴重病害，在全國各地均有發(fā)生。危害月季的葉與花，嚴重影響了其產量和品質，給農業(yè)生產造成巨大的損失。目前采用的化學防治方法易產生抗藥性、殘留和環(huán)境污染等問題，探討灰霉病的生物防治方法已迫在眉睫。
　　蚯蚓洗滌液來自蚯蚓的真體腔和背孔分泌的大量液體，是其他常見蚯蚓制品的副產品。我們采用平板濾紙片擴散法并結合大田實驗，探究蚯蚓洗滌液對月季灰霉病的防治效果。該項目是在前期研究的基礎上開展的第2期研究，尋找對灰霉菌起抑制作用的物質基礎，初步探討蚯蚓洗滌液防治植物灰霉病的機理。
　　實驗材料與方法
　　3實驗材料
　　供試土壤：北京一零一中學生態(tài)園內土壤(土壤有機質、氮、磷、鉀的平均含量為：1.04％、0.08％、0.11％、2.37％、pH值7.08±0.04)。
　　供試菌種：灰霉病菌(農科院植物保護所提供)。
　　供試蚯蚓品種：赤子愛勝蚓(北京一零一中學生態(tài)園內飼養(yǎng))。
　　供試培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。
　　供試作物：培養(yǎng)3年的月季幼苗。
　　葉綠素測量儀：SPAD-502、冷凍機、超凈工作臺、天平、自制篩筒等。
　　實驗方法
　　傘蚯蚓洗滌液抑菌性的測定實驗
　　蚯蚓洗滌液的制備：取蚯蚓100g干40目紗布篩中，置于容器上，用1000mL無菌水反復沖洗10次，所收集的液體即為蚯蚓洗滌液，于40℃冷藏備用。
　　濾紙片擴散法：制備真菌培養(yǎng)基平板，將經37℃過夜培養(yǎng)的灰霉菌，經顯微鏡計數后，稀釋成10℃FU/mL，將直徑1cm的濾紙片在10℃FU/mL灰霉菌液中浸泡5min，用無菌鑷子取出，平鋪在平板中心處，每皿4個濾紙片，其中3個處理，分別浸泡蚯蚓洗滌液原液(CT)、10“稀釋液(CT、)和10-2稀釋液(CL)，同時以無菌水浸泡的濾紙片作為對照。這4個濾紙片部分別在皿的四周，與中心濾紙片等距1.5cm，30℃倒置培養(yǎng)，定期觀察抑菌圈的形成情況，測量抑菌圈的大小并拍照，該實驗進行6個重復。
　　傘蚯蚓洗滌液抑制灰霉菌的大田實驗
　　在學校生態(tài)園實驗田筑4個哇，畦長9米、寬1米，全部種植月季，每畦種植2行，每哇30株。其中3畦為實驗組、1畦為對照組。對于3哇實驗組分別噴施等量的蚯蚓洗滌液CT、CTl、CT，對照組噴施等量的清水。噴施在生長期進行，從植株長出第1片真葉開始，每3天噴施1次，噴施在早晨8:OO前或下午4:00后進行。共噴施約21次。
　　當月季生長4周后(花期過后)，選取實驗組和對照組每哇3株，每株從頂部選取第4片葉，各畦10片葉，接種灰霉菌孢子懸液，3天后觀察記錄感染情況，葉片感染病斑的面積測定采用紙重比測定法。同時，注意觀察記錄花蕾數、花朵數、花朵大小、花辦多少及花期，觀察記錄時隨機取樣，每畦3株，計算出乎均值。
　　傘葉片感染病斑面積紙重比測定法
　　取透明的A4宣紙稱重，并測其面積，后將此紙依次連續(xù)4次1/2對折，每次對折都裁開，依次稱重，測其面積。以縱坐標為重量，橫坐標為面積，作標準曲線，將葉片感染的不規(guī)則面積用透明宣紙按其大小描繪下來剪下，稱其重量，在標準曲線上找其面積，該面積就是葉片感染的面積。
　　傘月季生長情況測定
　　在月季生長期，對其生長情況花蕾、花朵、花辦及花期進行測量記錄。
　　傘蚯蚓洗滌液成分的透析
　　將透析袋清理干凈，用夾子把透析袋一端夾好，從另一端注入去離子水，檢驗是否漏水。檢漏后，將蚯蚓洗滌液各30mL分別加入3個透析袋中，確保透析袋內無任何氣泡后，將一端用夾子夾好，將透析袋置于去離子水杯中(去離子水沒過透析袋)12～24h，然后將去離子水杯放入冰盒中，并放置在磁力攪拌器上。之后，將去離子水杯置于冷凍機內冷凍抽提，將抽提出的干物質(即袋外的)分別加20mL無菌水予以溶解后待用。
　　傘蚯蚓洗滌液透析袋內、外物質抑菌性實驗
　　取出透析袋內的溶液，同時和用上述抽提的干物質制成的溶液，進行抑菌實驗。
　　結果與分析
　　蚯蚓洗滌液抑菌性實驗的測定結果
　　由濾紙片擴散法測定的蚯蚓洗滌液抑菌實驗測定結果表明，培養(yǎng)24小時后，灰霉菌菌落距對照組邊緣有0.4cm，48小時后距對照組邊緣只有0.05cm，72小時后，距離為0，灰霉菌菌落己擴散到對照組。對照組沒有任何抑菌性能。蚯蚓洗滌液原液CT，其邊緣距灰霉菌菌落的距離，從24小時到72小時都保持在0.6cm，遠遠大干CT、和CT距灰霉菌菌落的距離。由此可見，蚯蚓洗滌液原液CT抑菌性能>CT>CT
　　蚯蚓洗滌液抑制灰霉菌的大田實驗結果
　　當月季生長4周后，花期過后，選取實驗組、對照組各10片葉隨機取樣，接種灰霉菌孢子懸液，3天后觀察感染情況(圖1)，用紙重比法測量其感染面積，結果表明，當幼苗期葉片接種灰霉菌孢子懸液后，實驗組和對照組連續(xù)5天分別噴灑蚯蚓洗滌液和清水，對照組灰霉菌感染面積達到171.87cm，而實驗組葉片無一感染，其抑制率為100％。對花蕾期和開花期的月季噴灑蚯蚓洗滌液，對照組噴灑清水后，植株長勢明顯不同，前者生長旺盛、茁壯，后者生長較弱。植株的花蕾數和花朵大小也明顯不同。見圖2。
　　由9月25曰的記錄(圖3)可以看出，實驗組CT、CTl、CT，月季單株的花蕾和花朵平均數分別為8.5、4.6，10.6、4.3、8.9、5.2，由成對t檢驗可知，各實驗組與對照組(CK)之間均具有顯著差異(P<0.01)，花朵的直徑和花朵的辦數也明顯多于對照組，花期也由原來的1個多月延長到4個月。說明實驗組CT、CTl、CT，的花蕾和花朵數顯著多于對照組(CK)。這是因為蚯蚓洗滌液不但具有抑制灰霉菌病的性能，而且含有豐富的營養(yǎng)成分和多種微量元素，具有促進月季生長的作用。
　　蚯蚓洗滌液透析后小分子物質的抑菌實驗結果
　　蚯蚓洗滌液透析抽提后，收集的干物質加20mL無菌水溶解制得的溶液，是小分子物質溶液，經檢測是抗菌肽物質。對該溶液進行如上文所述的濾紙片擴散法抑菌實驗表明，抑菌效果非常好，抗菌肽是蚯蚓等多種動物免疫防御系統(tǒng)的一個重要組成部分，其殺菌機理主要是作用于細菌/真菌的細胞膜，破壞其完整性并發(fā)生穿孔現象，造成細胞內容物溢出胞外死亡。該結論與資料調研分析是一致的。
　　蚯蚓洗滌液透析后透析袋內溶液抑菌性能結果
　　透析后留在透析袋內的液體，用濾紙片法進行72h抑菌性能檢驗，其結果表明，72小時后，CK、CT、CT、CT，幾乎都和中心的灰霉菌絲連在一起，說明它們對灰霉菌都沒有表現出明顯的抑菌性能，這也表明，留在透析袋內的大分子物質抑菌作用不明顯。
　　大分子物質和小分子物質溶液抑制灰霉菌的大田實驗
　　用透析袋內的大分子物質溶液和小分子物質制成的溶液進行防治月季灰霉病的大田實驗，也發(fā)現只有小分子物質溶液表現出抑制月季灰霉病的功效，而大分子物質溶液抑菌效果不明顯。
　　結論
　　實驗室與大田實驗結果表明，在月季葉片上噴施蚯蚓洗滌液能有效地抑制灰霉菌(真菌)的生長，防止植株受到灰霉菌的侵染，同時還能避免環(huán)境受到污染。透析研究表明：蚯蚓分泌液中具有明顯抑制灰霉菌作用的是大量的抗菌肽等小分子物質，抑制率達100％。抗菌肽殺菌的機理是作用于細菌的細胞膜，破壞其完整性并產生穿孔現象，造成細胞內容物溢出細胞外而死亡。
　　月季噴施蚯蚓洗滌液，可以使其植株生長旺盛、茁壯，花期由原來的1個多月延長到4個多月，產量大幅增加。
　　該項目獲得第26屆全國青少年科技創(chuàng)新大賽創(chuàng)新成果競賽項目中學組微生物學一等獎。
　　該項目開展了蚯蚓洗滌液對月季灰霉病的防治實驗，表明其具有良好的抑菌效果。實驗設計科學合理，數據翔實可靠，結果和結論可信，創(chuàng)新性明顯，有良好應用前